Western blot 생명과학 실험기법 (12주차).

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1 Western blot 생명과학 실험기법 (12주차)

2 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량
Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking Primary, secondary antibody incubation Developing (using chemidoc)

3 Introduction 단백질의 구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등
α-나선구조 β-병풍구조 비공유결합에 의한 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화(-S-S-)결합 등

4 Introduction Cell Lysis

5 Introduction Cell Lysis 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 0.1% SDS
1% NP-40 0.5% DOC (deoxycholate) (Option!) Protease inhibitor cocktail* *Protease inhibitor는 수많은 종류가 있어서 다양한 기전으로 여러 종류의 protease를 억제합니다. ​그러므로 하나의 protease inhibitor를 사용하는 것 보다는 다양한 protease 그룹을 억제할 수 있도록 여러 종류의 inhibitor를 섞어서 사용하는 것이 효율적입니다.

6 Introduction Western blot

7 Introduction Western blot DTT / β-Mercaptoethanol

8 Introduction BCA assay
단백질 용액에 Cu2+ 이온을 반응시킨 후, Bicinchoninic acid(BCA)가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법. - 562 nm 에서의 흡광도를 측정. - Standard curve로부터 농도를 결정. (Bovine serum albumin) - 다른 방법에 비하여 detergent (SDS, Triton) 등에 의한 영향이 적음. Bradford 용액

9 Introduction BCA method 1.083 0.689 Bradford 용액 OD값 BSA (μg/μl) 1 2 4
1 2 4 8 16 dosage 실험 결과 SDS-PAGE OD (y값) μg/μl (x값) X = (y )/0.0583 로딩량 (uL) /30ug 30/x값 5X loding dye DW (or RIPA) 총볼륨 =20μL A 1.083 1.7 4 14.3 20 B 0.689 2.8 13.2 Bradford 용액

10 Materials & Methods Cell Lysis
e-tube, scraper, PBS, centrifuge, RIPA, ice, DW, 96well plate, BSA, BCA [Dish에 직접 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하는 방법] E-tube 2개를 준비하여 각각 A, B로 labeling한다. Dish에 있는 배지를 버린 후, DPBS 5ml을 넣고 washing 해준다. DPBS를 제거하고, 200μL의 RIPA buffer를 넣어주고, scraper를 이용하여 cell을 긁어서 떨어뜨리고, 이를 모아 각 e-tube에 넣는다. 15초간 vortex 하고, 30~60분간 ice에 incubation 해준다. (5-10분마다 15초씩 vortex 하여준다) 5. Cell을 모은 e-tube를 13,000rpm으로 20분간 원심분리한다. 상층액을 따서 새로운 e-tube로 옮겨준다. (이후 tube는 ice에 꽂아두도록 함)

11 Materials & Methods Standardization BCA reagent (A : B = 1 : 50)
7. 96-well plate에 BCA reagent (A+B) 200-㎕를 측정할 Standard, Sample 수만큼 넣어준다. 8. BSA (2000㎍/ml)을 각각 (0.5, 1, 2, 4, 8 ㎕)을 넣어 standard를 준비한다. 9. Sample을 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 duplicate로 준비한다. 9. 37℃ 에서 20분간 incubation 한다. 10. Microplate reader로 562nm으로 측정 후, 정량곡선을 그린다. BSA BSA 1 BSA 2 BSA 4 BSA 8 BSA 16 A A B B BCA reagent (A : B = 1 : 50)

12 Plate layout Materials & Methods 농도 1 2 4 8 16 샘플 C 샘플 T

13 Result 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl 0.204 2.1 μg/μl
농도 OD 0.113 1 0.141 2 0.209 4 0.3 8 0.434 16 0.716 샘플 C 0.245 샘플 T 0.204 샘플 단백질 정량 결과 SDS-PAGE OD (y값) 농도 (x값, μg/μl) X = (y )/0.0376 A: 단백질 (30 μg) B: 5X dye C: DW 총부피 (A+B+C) C 0.245 3.2 μg/μl 9.4 μl 4 μl 5.6 μl 20 μl T 0.204 2.1 μg/μl 14.2 μl 1.8 μl

14 Discussion Q1. Lowry method, Bradford method에 대해 알아보세요
Q2. 실험수업에서 진행한 방식에 따라 BCA assay를 진행할 때, 샘플을 1 μl 가 아닌 2 μl를 취하여 OD를 측정하였다면 최종 농도는 어떻게 계산되어져야 할까요?