손동화, 류충호 (한국식품연구원, 경상대식공과)

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1 손동화, 류충호 (한국식품연구원, 경상대식공과)
천연물로부터 식품알레르기 제어소재 선발 손동화, 류충호 (한국식품연구원, 경상대식공과) 삼성병원 식품면역연구회

2 2) Th2 면역반응유도 → IL-4 등 분비 → IgE 항체생산 및 이를 복합적으로 활용하는 종합적 대응방안 필요
실험배경 및 중요성 최근 알레르기(아토피피부염, 알레르기성비염, 천식, 식품알레르기 등) 환자증가심각한 사회문제로 대두, 소아에게 많이 발증되는 식품알레르기 대응방안 필요 알레르기 발증 과정 1) 알레르겐 체내침입 2) Th2 면역반응유도 → IL-4 등 분비 → IgE 항체생산 → 아토피상태 [제1단계] 3) 재침한 항원이 IgE 항체와 결합 → mast cell 자극 → 탈과립유발 → 혈관확장, 호산구 등 세포이동 및 작용 → 알레르기성 염증반응유발 [제2단계] 각 발증단계 조절하는 활성물질발굴 및 이를 복합적으로 활용하는 종합적 대응방안 필요

3 연구의 필요성 근년, 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는 알레르기 (아토피피부염, 알레르기성
비염, 천식, 식품알레르기 등)는 사회적인 문제가 되고 있음. 미국에서는 5,000만명이 알레르기 질환을 갖고 있음 (의약품시장 $52억). 21세기에 주류 치료제는 알레르기와 당뇨에 대한 것임 (닛케이산쿄신문). 일본의 알레르기 의약품시장: 1,560억엔, 기능성식품시장: 약 600억엔임. 국내의 의약품시장: 500억원의, 기능성식품시장: 150억원으로 추정됨. 최근 일본 기능성식품의 특허출원, 1위: “항비만”, 2위: “항알레르기”임.  향후 높은 부가가치가 기대됨. 기존 연구에서는 단일소재의 단일활성에 대한 항알레르기 연구가 주류이나  선발을 위하여 다양한 소재들의 여러활성을 입체적으로 검토해야 함. 특히, 식품알레르겐의 소장상피세포층 통과를 억제하는 활성소재에 대한 연구는 전세계적으로 극히 미비한 상태임.

4 연구목표 및 내용 천연물 및 식품으로부터 식품알레르겐의 소장통과 및 알레르기 발증을 조절할 수 있는 물질들을 탐색하고, 유용성분을 활용하여 알레르기억제 기능성 식품소재를 개발 연구목표 연구내용 및 범위 항알레르기 활성소재 6종 이상 선발 3종 활성시험계 이용한 활성소재 선발 (1) 알레르겐의 소장통과 제어계 In vitro Caco-2 monolayer (2) IL-4 (Th2 cytokine) 생산 제어계 Ex vivo Murine spleen cell (3) 염증(탈과립) 억제 시험계 In vitro RBL-2H3 cell 4 4

5 연구방법 ○ 시료: 식품 및 천연물 106종 (1g) + 50% EtOH(25ml)  microwave (90w, 5min)  증발농축  최종 5mL로 조절  막여과후 활성시험 “발증단계별 조절 활성 측정”

6 In vitro Caco-2 monolayer 이용
알레르겐의 장 상피세포층 통과억제 소재선발 In vitro Caco-2 monolayer 이용 ○ 목적: 식품알레르기 발증 전 단계인 알레르겐 체내흡수를 제어하는 활성소재 발굴을 위해 소장 환경과 유사한 실험계를 활용 ○ 활성시험: Transwell 상에서 2~3주간 Caco-2 cell 배양  monolayer 형성 확인  상층부(0.5mL)에 시료(10uL) 첨가  1시간 후 알레르겐(OVA)과 bile salt(150ug/mL) 첨가  3시간 후 TEER측정/ 하층부(1.5mL)의 OVA측정 by ELISA *TEER: 세포층이 가지는 전기적 저항치/장상피세포 간극의 건전성 지표로 활용 ○ [Rel. Reflux < 20%] & [Rel.TEER >100%]  #4, 17, 54, 78, 101, 103 (IC50 < 10ug/mL) /#14, 63, 104

7 IL-4 생산억제 활성소재선발 감작생쥐 비장세포배양계 이용
○ 목적: 알레르기 발증의 제1단계 (Th2반응에 의한 아토피상태로의 발전)를 제어하는 활성소재 발굴 ○ 활성시험: Ex vivo 비장세포배양 BALB/c생쥐, 암컷(5주령)  1주후: OM(50ug)을 alum(2mg)과 함께 2주간격 2차례 복강면역하여 알레르기유발  1주후 비장세포 배양: 항원 존재하에 소재추출물을 첨가  3일후 상징액 중 IL-4 분석(ELISA) ○ IL-4 생산억제 70% 이상  #2, 7, 79, 98 (IC50=~10ug/ml) / #16, 23, 35, 47, 48, 78, 101, 103

8 탈과립억제 활성소재선발 RBL-2H3 세포배양계 이용
○ 목적: 알레르기 발증의 제2단계 (항원자극에 의한 탈과립으로 유도되는 염증반응) 제어소재의 발굴 ○ 활성시험: In vitro RBL-2H3 세포주 배양 ○ Histamine 유리억제 활성시험   24well에 seeding  하룻밤후: 소재추출물 처리  1시간후: 자극제(A23187+PMA) 처리  8시간후: 배양액 회수  Histamine 정량 (by ELISA) ○ β-hexosaminidase 유리억제 활성시험    24well에 seeding, 0.5 ug/ml anti-DNP IgE 첨가  하룻밤 배양  Siraganian 완충액으로 세척  소재추출물 10 ㎕를 첨가  DNP-HSA (1㎍/ml) 20㎕를 첨가  상징액 회수  β-hexosaminidase의 활성 측정 (A405) Histamine 분비억제 활성 Sample No. ○ Histamine 유리억제 50% 이상  #5, 7, 49 (IC50=~50ug/ml) / #33, 42, 61, 66, 67, 79, 83, 100, 101, 105, 106 ○ β-hexosaminidase 유리억제 40% 이상  #5, 83, 101, 106/ #7, 21, 49, 57, 61, 66, 79, 87, 100, 105 ○ 결과: 두 활성간에 상관성 높음

9 알레르기 억제활성 (종합) ○ 입체적인 활성소재의 비활성 파악에 용이 ○ 혼합을 위한 기본소재의 선발에 활용

10 활성소재 선발 ○ 우선 선발기준: ○ 활성 특성비교: 3종의 활성시험에서 높은 활성을 나타낸 것 식품 소재를 중심으로 선발
○ 우선 선발기준: 3종의 활성시험에서 높은 활성을 나타낸 것 식품 소재를 중심으로 선발 - 독성의 문제가 있는 것은 제외  9종 선발 ○ 활성 특성비교: 활성시험 결과 점수 합계 알레르겐의 장상피세포층 통과저해 IL-4생산 저해 탈과립 저해 #4 +++ + 5+ #5 #16 ++ 8+ #33   6+ #35  #86 #98 7+ #101  #106

11 선발소재혼합(1:1)에 의한 상승작용 활성 종류 우수 활성소재 1:1혼합  상승작용 [일부Data 생략]
○ IL-4생산 억제활성에 미치는 영향 (Fig.) 혼합에 의한 상승작용 확인 처리구: (36)  (13개) 상승작용에 관여하는 중요 활성소재: (4개) #33, #86, #98, #106 단독 (9) :1혼합 (36) ○ Ex vivo 결과 종합 ○ 소재(9종): #4, #5, #16, #33, #35, #86, #98, #101, #106 활성 종류 우수 활성소재 1:1혼합  상승작용 [일부Data 생략] 소장통과 억제활성: #4, #16, #101 #4, #16, #35 IL-4생산 억제활성: #16, #98 #86, #106, #98, #33 탈과립 억제활성: #5, #106 #5, #101, #16, #98

12 요약 / 결론 106점의 식품 및 천연물로부터 알레르기 제어 관련 3종의 활성시험을 도입하여 활성을 측정하고 이들 소재가 가지는 활성을 입체적, 상대적으로 비교함으로써 9종의 활성소재를 우선 선발. (1) 알레르겐의 소장상피세포 통과 억제 활성소재 : 감초 등 (2) Th1/Th2 면역반응 (제1단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 IL-4생산억제 활성소재 2종: 녹차 등 (3) 알레르기성 염증반응 (제2단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 탈과립억제 활성소재 2종: 강황 등 * 그 외에 여러 활성이 고르게 높은 활성소재: 민들래 등 선발소재 9종 추출물을 혼합(1:1)시 상승작용을 나타내는 소재 확인.  혼합물을 항알레르기 소재로 활용가능