전기영동.

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1 전기영동

2 Protein

3 SDS

4 2. Sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel electrophoresis의 원리

5 Polyacrylamide 의 구조 Bisacrylamide에 의해 교차연결 된다.

6 Loading Stacking gel Separating gel

7 N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine
for actually separating polypeptides by size Polyacrylamide gel 조성 to sweep up proteins in a sample between two moving boundaries 7.5% Separating gel (10ml) 4% Stacking gel (10ml) Acrylamide/bis(30/0.8) 2.5ml 1.3ml DW(Distilled water) 4.85ml 6.1ml 1.5M Tris-HCl, pH8.8 0.5M Tris-HCl, pH6.8 10% SDS 0.1ml 10% ammonium persulfate 50㎕ TEMED 5㎕ Add to accelerate acrylamide polymerization N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine

8 두 가지 Gel의 차이점 stacking gel은 pH가 6.8이고 running gel은 pH가 8.8입니다
이유 : stacking gel 상에서는 단백질이 이동을 거의 하지 않고 running gel 위치에 도달했을 경우 갑자기 속도가 빨라지게 됩니다. 그렇게 되면 단백질을 꼭꼭 눌러주는 역할을 하게 되는 것인데요 stacking gel을 사용하면 sample이 동일한 위치에서 전개되는 효과를 줄 수 있습니다.

9 makes the sample more dense than the sample buffer
Preparation of sample ;an anionic detergent ;denatures secondary and non–disulfide–linked tertiary structures ;applies a negative charge to each protein in proportion to its mass. Sample buffer makes the sample more dense than the sample buffer 1M Tris-HCl(pH6.8) 60mM 0.6ml 50% glycerol 25% 5ml 10% SDS 2% 2ml 2-mercaptoethanol 14.4mM 0.5ml 1% bromophenol blue 0.1% 1ml H2O 0.9ml ;a reducing agent ;further denatures the proteins by reducing disulfide linkages, thus overcoming some forms of tertiary protein folding, and breaking up quaternary protein structure

10 Preparation of sample

11 Preparation of sample

12 전기영동    1) 물질의 크기 및 분자량에 따라 물질을 분리    2) 물질의 실제 전하에 따라 물질을 분리

13 The First Dimension : Isoelectric Focusing (IEF)
-> pI 값에 따른 단백질의 분리 여러 종류의 혼합된 단백질들이 pH range 3-10 IPG Strip 상에서 단백질의 크기와는 관계없이 pI 값에 따라서만 분리 되어짐

14 The Second Dimension : SDS-PAGE -> 분자량에 의한 단백질 분리
14

15

16 Westernblot

17

18 Chromatography

19 1. Chromatography ? Chromatography란 혼합된 시료성분이 분리관(column)의 고정상(stationary phase)과 이동상(mobile phase)을 통하여 흐르면서 시료가 고정상과 이동상 사이의 분배작용, 흡착작용, 이온교환, 시료의 크기 차이에 의한 배제작용 등의 물리적, 화학적 작용을 일으켜 각각의 단일성분으로 분리되는 현상으로 혼합물 중의 분리, 정성, 정량 혹은 정제 등에 이용된다.

20 2. History of chromatography
- 1850년 F.F.Runge가 여과지를 이용하여 염료를 분리한 것에서 유래(Paper Chromatography) 2) Chromatography의 어원 - 1906년 M.Tswett가 흡착제를 충진시킨 유리관을 이용하여 식물의 색소를 분리시키면서 명명 - Chromatography = Chromos(color) + graphy(write)

21 2. History of chromatography
1941년 Martin과 Synge에 의해 발전된 액체-액체 크로마토그래피(LLC)이다. 단 하나의 고체 흡착제 대신에 그들은 불용성 흡착제를 고정상에 결합시킨 고정 액상을 사용했다. 용질 성분은 용해도에 따라 두 액체 (고정상과 이동상)에서 서로 이루어진다. 이후 크로마토그래피 기술은 발전을 거듭하여 최근에는 HPLC가 널리 각광을 받고 있는데 이는 비휘발성 용질이나 열에 약한 시료의 신속한 분리 기술로 인정받고 있다.

22 Classification of Chromatography
- Paper Chromatography - LC (Liquid Chromatography) – TLC, HPLC - GC (Gas Chromatography)

23 3. Column chromatography
Stationary phase 정지상(Stationary phase) – Column, Paper, Plate 이동상(Mobile phase) –Gas, Liquid, - 혼합시료를 이동상의 흐름에 따라 정지상을 통과시키면, 시료의 구성성분에 따라 이동률(migration rate)이 다르다는 것을 이용하여 물질을 분리 시키는 방법 A+B+C  A, B, C Chromatography 기술은 혼합물의 separation, isolation, 동정, 정량에 아주 유용한 방법이다. A C B Mobile phase Column, Paper, Plate Gas, Liquid

24 3. Column chromatography
Column 은 유리관(column)과 같은 원기둥 모양의 관에 산화알루미늄이나 이온교환수지 등을 충전한 것이다. 칼럼의 충전제로서 산화알루미늄 ·활성탄 ·산화마그네슘 등을 사용한 것을 흡착크로마토그래피, 녹말 ·셀룰로오스 등을 사용한 것을 분배크로마토그래피, 이온교환수지를 사용한 것을 이온교환 크로마토그래피 및 분자크기를 이용하여 분리하는 것을 크기배제크로마토그래피라고 한다.

25 Fundamentals of column chromatography
흡착 크로마토그래피 (액체-고체) 실리카젤, 알루미나 정시상의 silanol 그룹과 시료의 극성 작용기와의 상호작용을 이용하여 비극성 물질 분리 분배 크로마토그래피 (액체-액체) 불활성 지지체의 흡착 혹은 결합된 액체층으로 극성과 비극성 모두 된다. 시료가 이동상과 정지상 액체에 용해도 차에 따라 분배 됨으로써 분리됨 이온교환 크로마토그래피 이온 그룹을결합시킨 다공성 수지 분석하고자 하는 시료에 있는 이온종과 정지상의 전하 (시료와 반대 전하를 가짐) 와의 상호작용을 이용하여 분리 크기 배제 크로마토그래피 화학적으로 불활성인 다공성&3차원적으로 네트웍을 이룬 겔 혹은 무기 고체 시료를 크기 별로 분리한다. 크기가 작은 시료는 정지상의 작은 구멍까지 다 거쳐 나오므로 컬럼을 빠져나 오는데 시간이 오래걸린다

26 4. Adsorption chromatography
최초로 사용된 분석법 고정상으로 사용하는 컬럼과 분석하려는 시료간의 흡착력을 이동상으로 사용하는 용매가 서로 떨어뜨리는 차이  고체-액체 크로마토그래피 흡착제로는 실리카겔, 활성알루미나 ·활성탄등이 사용되며 이동상으로 Hexane, n-propanol 등이 사용 수소결합 (hydrogen bonds), Van der Waals force 정상 (Normal phase) Chromatography : 고정상  극성(Silica), 이동상  비극성 일반적으로 비극성 용매에 녹는 시료 분석에 사용 이동상의 극성이 강할수록 머무르는 시간이 감소, 시료분자의 극성이 클수록 머무르는 시간이 증가 Si-OH Si-OH---OH O Hexane polar

27 5. Partition chromatography
액체-액체 크로마토그래피 정지상이 지지체에 물리적으로 흡착되어 있음  (예 : Paper chromatography) 간단한 예로 종이를 용매에 담가두었다가 (정지상을 물리적으로 흡착시키는 방법이라 할 수 있다.) 꺼내말린 후 시료로 종이에 작은 점을 찍고 이동상에 담근 후 시료의 정지상과 이동상에 대한 용해도 차이로 물질을 분리하는 방법 이때 정지상과 이 동상은 용매 성질 이 매우 달라 서로 에 대해 용해도가 없어야 한다. Bonded phase chromatography 정지상이 지지체에 화학적으로 결합되어 있음. 액체-액체 크로마토그래피가 갖고 있었던 문제 (서로 섞이지 않는 두 용매를 찾기 어려움, 정지상이 이동상에 점점 고갈됨, solvent gradient를 할 수 없음) 대부분 해결, 최근 대부분의 HPLC를 이용한 분석을 BPC로 행해지며 고정상의 극성과 이동상인 극성에  따라 순상 크로마그래피와 역상 크로마 토그래피로  분리한다.

28 Normal phase chromatography
극성 칼럼, 비극성 용매 옛날에는 실리카 칼럼에 물을 흡착시킨 극성 컬럼에 비극성 이동상이 사용되어져 왔기 때문에 BPC에서도 극성 컬럼에 비극성 이동상을 사용하는 방법을 정상(normal phase) 크로마토그래피라 정의하게 되었다. 가장 비극성인 물질이 가장 먼저 용리되어 나오며(이동상에 대한 용해도가 가장 높으므로) 이동상의 극성을 증가시켰을 때 머무름 기간이 증가한다. 이동상 : Ethyl ether               Chloroform               n-hexane               비극성 용매사용

29 Reverse phase chromatography
비극성 컬럼, 극성 용매 HPLC 분석에 있어 대부분의 실험이 역상크로마토그래피가 이용되며 정지상으로 octadecyl silane , Octyl silane, 이동상으로는 물과 메탄올, 아세토나이트릴과 같은 물과 잘 섞이는 유기 용매가 사용됨. 역상 크로마토그래피의 좋은점 1. 같은 종류의 컬럼과 이동상으로 비이온성, 이온성 화합물을 분리할 수 있다. 2. 역상 크로마토그래피 컬럼은 비교적 안정하여 별다른 주의가 필요없다. (단 pH는 7이 넘지 않도록 주의) 3. 역상 크로마토그래피에서 사용되는 이동상은 저렴하고 쉽게 구할 수 있다. 4. 시료의 비극성이 증가 할수록 머무름 시간이 증가하므로 혼합물의 용리 순서를 쉽게 예 측할 수 있다. 5. 컬럼의 평형이 빨리 이루어지므로 기울기 용리시 용매 조성 변화를 빨리 바꿀 수 있고 분석이 끝나면 빨리 초기화 시킬 수 있다.

30 6. Ion exchange chromatography
1970년대부터 발달되기 시작하여 아미노산, 유기산 및 다른 복잡한 이온종의 분리에 많이 이용되고 있다. 이온 크로마토그래피는 전화를 띠고 있는 정지상을 사용하며, 정지상의 전하와 반대 전화의 짝이온을 포함한 용매를 이동상으로 사용한다. 이동상에 포함된 짝이온을 정지상과 이온쌍을 이루며 이동상과 같은 전하를 가진 시료가 주입되었을 때 다음과 같은 식이 성립된다. 양이온 교환 X+ + R-Y+ Y + + R-X+        X = 시료이온, Y = 이동상의 이온 음이온 교환 X- + R+Y- Y -+ R+X-          R = 정지상의 전화 부분 시료의 이온과 이동상의 이온은 정지상의 전하에 대해 서로 경쟁적인 관계 에 있다.

31 Theory of ion exchange - + + + + + - I. Starting condition II.
Adsorption of sample - III. Starting desorption + + IV. End of desorption + V. Regeneration

32 7. Size exclusion chromatography
분자량이 큰 유기물(예: 고분자)을 분리하거나 분자량을 구할 때 사용한다. 정지상으로 고분자 입자나 실리카 켈을 사용하며 일정한 크기의 구멍을 갖는 삼차원적으로 네트웍을 이룬 구조를 갖는다. 머무름 시간은 시료의 크기에 의해 결정되는 데 시료의 크기가 작을수록 머무름 시간이 길며 정지상이 이룬 구멍보다 큰 시료의 경우에는 빨리 용출되어 나온다. Gel Permeation Chromatography (GPC) : 비극성 용매에 녹는 시료 분석시 사용, 비극성 이동상, 소수성 컬럼 사용 Gel Filteration Chromatography (GFC) : 수용액에 녹는 시료 분 석시 사용, 이동상으로 수용액, 친수성 컬럼 사용 응용범위 1. 큰 분자량을 갖는 천연물을 저분자량 분자나 염(salt)와 분리할 때 사용 (예 : 단백질을 아미노산이나 펩티드로부터 분리할 때) 2. Oligomer의 분리 3. 분자량의 계산

33 겔 여과크로마토그래피(gel filtration chromatography) 분자를 크기에 따라 분획할 수 있는 방법
  분자를 크기에 따라 분획할 수 있는 방법 가교한 dextran gel(Sephadex), polyacrylamide gel(Bio-gel), agarose gel 등을 작은 입자상으로 가공한 것을 충진제로 이용 겔 여과크로마토그래피(분자체)   겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)는 투석과 마찬가지로 분자를 크기에 따라 분획할 수 있는 방법이다. 가교한 dextran gel(Sephadex), polyacrylamide gel(Bio-gel), agarose gel 등을 작은 입자상으로 가공한 것을 충진제로 이용한다. 이 고분자 gel의 입자는 다수의 매우 작은 체(篩) 구멍이 있는 작은 공과 같아서 이것을 채운 칼럼에 여러 가지 크기의 분자량을 가진 단백질 혼합물을 가해서 용출시키면 체 구멍보다 큰 지름을 가진 단백질 분자는 확산하지 않고 그대로 칼럼에서 유출하고, 체 구멍을 통과하는 작은 단백질 분자는 충진제 중에 확산하면서 column을 통과하므로 천천히 유출한다. 그러므로 분자의 크기에 따라 단백질을 분획할 수 있다.(그림 3.24 참조) 이러한 겔 여과 칼럼을 분자체(molecular sieve)라 한다. 33

34 + 9. Principle of affinity chromatography S L
Affinity chromatography는 biospecific regend(L)와 분리하고자 하는 시료(S)의 친화성을 이용하여 분리하는 방법으로 비교적 최근에 많이 이용되는 방법으로 주로 enzyme, antibody, lectin, nucleic acid, hormone등의 분리에 이용한다. + L S

35 8. Choice of column chromatography
Sample M.W. < 2000 M.W. > 2000 Organic solvent soluble Water Organic solvent soluble Water MeOH&MeOH-Water Solvent soluble Hexane soluble THF Gel Filtration (Aqueous) Ion Exchange Reverse phase, Bonded GPC Ionic Normal phase, Adsorption Bonded Reverse phase, Small Mol. GPC Reverse phase Ionization Control Paried ion Ion Exchange

36 HPLC High Performance Liquid Chromatography (고속액체크로마토그래피)

37 HPLC system 안녕하십니까? 류은미입니다. 앞에서 HPLC의 원리 및 컬럼의 선택에 대하여
Title

38 HPLC system * 탈기 장치 (Degasser) * 송액 장치 (Solvent Delivery systems:pump)
* 시료 주입기 (Injectors) * 컬럼 (Columns) * 컬럼 온도 조절기 (Thermostatted Column Compartment) * 검출기 (Detectors) HPLC의 구성에 대하여 알아보겠습니다. HPLC는 이동상으로 액상을 사용하는 기기 장치입니다. 그러므로 이동상의 탈기를 위한 장치가 우선 필요합니다. 그 다음으로 PUMP, 시료 주입기, 컬럼, 컬럼 온도 조절기, 검출기 순으로 구성되어 있습니다. HPLC

39 HPLC Systems ---- detector pump column injector - 이동상의 용액을 관내로 흘려주는 역할
- Gradient 시료 검출기 Signal 화 - Stationary phase - 물질을 분리 하는 역할 ---- column pump detector injector solvent resorvoir -시료 주입구 - 신호 처리 장치 a b c a b c Mobile phase 이동상의 용액

40 HPLC Systems A C B Mobile phase Pump Injector Detector Computer Column
Peak Intensity Time

41 탈기(Degassing) 1. 목적 : 이동상의 용존 산소, 질소 및 기포 등을 제거한다.
이동상의 조건 Column 의 특성을 바꾸어서는 안된다. 검출기에 적절해야한다 시료를 녹일 수 있어야 한다 점도가 낮아야 한다 시료의 회수가 용이해야한다 순도가 높고 오염물이 없어야 한다 가격이 저렴하고 구입이 용이해야 한다. 1. 목적 : 이동상의 용존 산소, 질소 및 기포 등을 제거한다. 2. 방법 : * He sparring * Vacuum(filtration) * Ultrasonication * On-line Degassing Special plastic membrane tubing Solvent reservoir To pump Vacuum chamber 탈기에 대하여 알아보겠습니다. 이동상의 탈기 목적은 ....있습니다. 탈기 방법으로는 다음의 4가지 방법이 있습니다 He sparging 방법은 이동상에 분석하는 동안 지속적으로 He을 주입하는 방법입니다. 이 방법은 고가의 헬륨을 사용해야 하는 것과 분석하는 동안 이동상의 휘발성이 문제가 되고 있습니다. Vacuum 방법은 일반적으로 탈기와 여과의 방법을 병행하여 사용하고 있습니다. 이동상을 압력으로 빨아 들이는 방법이며 이때 이동상이 여과지를 통과하도록 하는 방식을 취하여 이동상에 존재하는 입자를 제거합니다. Ultrasonication 방법은 제조한 이동상에 30분 이상 sonication을 시키는 방법으로 일반 실험실에서 가장 손쉽게 사용할 수 있습니다. 그러나 탈기 효율이 다른 방법에 비하여 떨어지며 시간이 많이 걸리는 단점이 있습니다. 온라인 탈기 방법은 이동상의 탈기를 기기를 통하여 분석동안 자동으로 하는 방법입니다. 분석 진행동안 일정하게 자동으로 유지되며 별도의 다른 방법을 필요로 하지 않는 장점이 있습니다 Degassing

42 송액 장치:Solvent Delivery System(Pump)
1. 역할 : 이동상을 이동상 저장용기에서 끌어들여 시료 주입기로 연속적으로 밀어 준다. 2. 요건 : 일정한 유속과 압력을 유지할 것. 다양한 용매를 사용할 수 있을 것. 3. Isocratic 및 Gradient * Isocratic - 분석시간 동안 이동상 조성의 변화가 없다. * Gradient - 분석시간 동안 이동상 조성이 시간의 흐름에 따라 변한다. 이제 용매 전달 장치인 펌프에 대하여 알아보도록 하겠습니다. 펌프의 역할은 ...입니다. 이때 펌프가 지녀야할 요건은 ... 여기에서 잠시 isocratic과 gradient라는 용어에 대하여 설명드리고 넘어가도록 하겠습니다. 여러분들께서 분석에 대한 자료를 보시다 보면 용매 조건에 isocratic과 gradient라는 말을 볼수 있게 됩니다. isocratic 이라는 것은 .. gradient 라는 것은.. 다시 말해서 이동상으로 물과 메탄올을 사용한다고 가정해 봅시다. 물과 메탄올의 비율을 50:50으로 분석 동안 계속해서 변함없이 사용한다면 이경우는 isocratic에 해당됩니다. 반면 물과 메탄올이 50:50의 비율로 분석을 시작하여 점차 메탄올을 증가시켜 분석하는 방법이라면 이는 gradient에 해당합니다. gradient 방법은 시료간의 분리가 제대로 되지 않아 그 분리도를 높이려 할 경우 혹은 분리 시간이 너무 길어 분석시간의 조절이 필요한 경우에 사용됩니다. SDS

43 Sample: Synthetic peptide: Column: Sephasil Peptide C18 5 μm ST 4
Eluent A: 0.06% trifluoroacetic acid (TFA), pH 2.5 Eluent B: 84% acetonitrile in 0.055% TFA Gradient: (A) % (B) % Flow: 1 ml/min

44 시료 주입기 (Injectors) 1. 역할 : 분석하고자 하는 시료를 용매의 흐름에 실어 준다.
2. 종류 : * 수동 (Manual Injection Valve) * 자동 (Auto Injector) 시료 주입기에 대하여 알아 보겠습니다. 시료 주입기의 역할은 ... 종류로는 .... 작동 원리에 대하여 알아 보겠습니다. Injector

45 컬럼 (Column) 무기 세라믹 소재 또는 고분자 합성물질이 충진 혼합성분들을 각각의 단일성분으로 분리시키는 기능
어떤 물리적, 화학적 변화도 잘 적응 할 수 있어야 합니다. 일반적으로 컬럼 안에 있는 물질들을 충진제(packing material)라 함. [ 실리카(silica), 알루미나(alumina) 합성 고분자(organic polymer)]

46 Column-Packing Material
Silica - 가장 많이 사용되는 물질 - 약산성의 성질 (사용 가능한 범위 – pH 2~8) - 역상 컬럼(Reverse phase), 이온교환(Ion-exchange), 친수성 작용 (Hydrophilic-interaction), 소수성 작용 (Hydrophobic-interaction) 및 크기배제(Size-Exclusion) Silica Stylene-Divinylbenzen Methacrylate 유기용매 (Organic solvent) Very Good Good pH영역 (pH range) Bad (pH 2~8) Very Good(pH 1~13) Good(pH 2~11) 지지체 강도 (Swelling/Shrinking) 물리적 특성 (Pressure capacity) High pressure stable 0~3,000psi 0~1,500psi Middle pressure 0~800psi 표면 가공 (Surface chemistry) 분리 효율(Efficiency)

47 Column-Packing Material
Si 실리카 (Silica) 구조식 : Si-OH 전통적인 순상 (Normal Phase) 물질로, 비 이온성(non-ionic)을 가진 비극성(none polar)이나 극성(polar)인 유기물질을 분석하는데 많이 사용된다. C18 옥타데실 (ODS, RP-18, LC18, Octadecyl) 구조식 : Si- C18H37 전통적인 역상 물질이며, 비극성 시료에 대해 잘 머무르는 기능을 가지고 있으며, 매우 탁월한 이론 조절 (Ion-pairing)크로마토그래피로 사용이 매우 좋다. 환경물질, 지방산, 비타민, 약물, 생물 등의 다양한 활용처를 가지고 있다. NH2 아민(Amino, APS, Amino Propyl Silyl) 구조식 : Si- C3H6NH2 역상, 순상 및 약 음이온교환 물질로 활용이 가능하다. 역상: 당 분석용으로 많이 사용되며, 순상: 실리카 컬럼을 대체 할 수 있으며, 작은 양의 물에도 반응하지 않는 장점이 있다. 이온 교환: 완충 용액을 사용하여 약 음이온 교환 기능을 가진 컬럼으로 활용이 가능하며, 음이온, 유기산 분석에 좋다.

48 역상 컬럼(reversed phase column)이 좋은 이유
* 역상컬럼 : 고정상(비극성) / 이동상(극성) -- 극성물질 먼저 용리 역상 크로마토그래피의 좋은점  1. 같은 종류의 컬럼과 이동상으로 비이온성, 이온성 화합물을 분리할 수있다.  2. 역상 크로마토그래피 컬럼은 비교적 안정하여 별다른 주의가 필요없다. (단 PH는 7이 넘지 않도록 주의)  3. 역상 크로마토그래피에서 사용되는 이동상은 저렴하고 쉽게 구할 수 있다.  4. 시료의 비극성이 증가 할수록 머무름 시간이 증가하므로 혼합물의 분리되는 순서를 쉽게 예측할 수 있다.  5. 컬럼의 평형이 빨리 이루어지므로 기울기 용리시 용매 조성 변화를 빨리 바꿀 수 있고 분석이 끝나면   빨리 초기화 시킬 수 있다.

49 Detectors 1. 역할 : 컬럼에서 분리된 시료가 일정한 간격으로 검출기
를 통과할 때 시료의 존재 및 양을 일정한 규칙에 의해 인식하여 전기적인 신호로 바꾸어 준다. 2. 종류 : * 가변파장 검출기(Variable Wavelength Detector) * 다이오드 어레이 검출기(Diode-Array Detector) * 형광 검출기(Fluorescence) * 굴절률 검출기(Refractive Detector) * 전기화학 검출기(electrochemical Detector) * 전도도 검출기(Conductivity Detector) Detector

50 UV-Vis detector 원리. - 광원에서 특정 파장의 빛이 광로를 거쳐 검출기 셀 내의 시료에 투입되면 특정 파장의 빛이 시료에 흡수. - 검출기에 얼마 만큼 빛이 흡수 되었는가를 전기적인 신호로 나타내고 이 신호의 크기를 이용하여 시료의 정량 분석이 이루어짐. 사용 범위. - 많은 용질들이 자외선을 흡수 하고, 검출기의 감도가 상당히 높기 때문에 HPLC 검출기로 가장 많이 사용되고 있음. - 사용이 간편하고, baseline 안정화 시간이 짧고 파장 선택 조절이 가능. - 흡수가 없는 용매를 사용한 기울기 용리(gradient elution)에 적합.

51 UV/VIS 검출기를 이용한 약물 분석 UV/VIS Detector

52 DAD 장점(PDA) 1. 신속한 전파장 스펙트럼 확인 : 보다 많은 분석 정보 제공
2. 다파장 검출 : 감도와 선택성을 증가시키기 위한 기술로 사용 3. 탁월한 파장 재현성 : 스펙트럼 비교를 통한 신뢰성 확보 4. 기기의 신뢰성 : 움직임 부분의 최소화로 인한 높은 신뢰성 제공과 기기 사용 효율의 최대화 5. 빠른 검교정 : 모든 파장에 대하여 동시에 가능 Diode-Array Detector

53 Electrochemical detector
원리. - 분석물질을 전기를 이용하여 강제로 산화/환원하여 검출 - 분석 물질이 쉽게 산화 되거나 환원되어야 하므로 약간 선택적. - 예를 들어 페놀, 방향족 아민 과산화물, 머캅탄은 산화에 의해 검출되고, 케톤, 알데히드, 방향족 할로겐은 환원에 의해 검출. 특징 검출될 수 있는 분석 물질에 대해서는 아주 감도가 높고, 검출 한계가 나노 암페어 까지 측정할 수 있다. - 전해질이 녹아 있는 수용액이나 다른 극성 용매가 필요하며, 이것은 산소가 전혀 없어야 한다. - 이 검출기는 흐름 속도와 온도 변화에 민감.

54 Refractive index(RI) detector
원리. - Reference cell과 sample cell에 포함된 시료와 용매의 굴절률 차이가 존재하게 되고, beam이 광전관 중심으로부터 deflect 되고 검출기의 신호가 변한다. - 자외선 검출기 보다 감도 약 1000배 낮고, 검출기가 이동상의 조성에도 영향을 받기 때문에 기울기 용리에는 사용되지 않음. - 압력과 온도 변화에 민감하여 흐름 속도가 일정해야 하며, 온도 변화도 0.01 ℃이내로 일정해야 한다. 사용 범위. - 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용할 수 있으나, 감도가 낮기 때문에 미량 분석에는 사용되지 않고, 자외선 흡수가 없는 거의 없는 탄수화물과 지방족 중합체와 같은 물질에 일반적으로 적용.

55 Fluorescence detector
원리. - 시료에서 발광하는 형광의 세기는 시료의 양(농도)에 비례하는 원리. - 시료가 형광을 방출 할 때 혹은 시료를 형광을 낼 수 있는 화학기를 원하는 분석 물질에 붙여서 형광 유도체로 만들었을 때 사용 감도가 아주 좋지만, 오직 형광을 내는 제한된 범위의 분석 물질에 대해 서만 사용 가능. 사용 범위. - Uv detector보다 100 ~ 1000 배 정도 선택성이 좋다. - 생화학, 의학, 공중보건, 약리학, 석유 화학 분야. - Polycylic armatic, Aflatoxin류, Amino acid류.

56 Detector 사용 현황 Fluorescence 10.0% Refractive Index 8.0%
Electrochemical 7.0% Conductivity 5.0% DAD(PDA) 22.0% Mass spec 1.0% Others 4.0% UV/VIS(VWD) 43.0% Detector

57 Experiments 1. 이동상 제조

58 2. Filtration and degassing

59 3. 펌프내부 기포제거

60 4. Column 확인

61 5. Pump 압력 확인

62 6. Column 누수 확인

63 7. 온도 확인

64 8. UV Detector

65 9. Sample preparation

66 10. Sample filtration

67 11. Injection

68 Analitical result from HPLC