4장. 핵산의 구조 분자생물학.

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1 4장. 핵산의 구조 분자생물학

2 핵산의 연구 Methylene blue와 Hematoxilin으로 염색. Feulgen staining으로 염색되는 물질.
Chromatin : 그리스어 Chroma (Color). 1847. F. Miescher : 연어의 정액 (핵산 추출). 1899. Altmann : 송아지 흉선 ; 핵 단백질 분리 (소금 절임). 남은 용액 ; DNA 분리 (에탄올 처리). 효 모 ; RNA 추출.

3 핵산의 구성 물질 Nucleotide : Sugar + Base + Phosphate.
Sugar : Pentose (Ribose, Deoxyribose). Base : Purin (A, G), Pyrimidine (T, C, U).

4 핵산의 구조적 세가지 요소 Nucleotide : Phosphate + Sugar + Base

5 핵산의 구성 성분

6 Nucleotide의 두 가지 예 아데노신 및 염기의 구조

7 DNA에 일반적으로 존재하는 4 종류 nucleotide의 구조

8 dAMP, dADP, dATP의 구조 Nucleotide 의 구조

9 Base(염기)의 구조

10 RNA의 1차 구조

11 핵산의 중합반응(Polimeryzation) (중합효소 : Polymerase)

12 DNA의 1차 구조

13 DNA 이중나선의 역 평행구조

14 DNA의 상보적 염기 쌍

15 DNA의 도표식 모사

16 DNA 상보적 사슬의 역 평행구조

17 DNA 이중나선의 꼬인 모양

18 DNA 이중나선 모식도

19 DNA 이중나선 공간 채우기 모델

20 DNA 나선형태 : Z-DNA, B-DNA

21 DNA 나선 형태 B type DNA A type DNA 명칭 모양(형태) 회전방향 1회전당 염기수 상대습도 염기 쌍의 특징
B DNA Native form Right handed (우선성 DNA) 10bp 92% 나선 축에 수직 정상 buffer 내에서 ds DNA ( 대 홈, 소 홈 존재) Z DNA Zigzag form Left handed (좌선성 DNA) 13bp 66% 나선 축에 20⁰경사 2 M NaCl 용액에서 ds DNA : 파도모양

22 DNA X선 회절 사진

23 DNA 물리적 특성 당-인산 골격 (back borne)을 갖고 있는 우선성 이중나선(double strand : ds) 구조이다. 두 가닥의 직경은 20 Å 이다. 이중나선 구조는 base staking interaction 작용으로 소수 성 상호작용에 의해 안정한 구조를 갖는다. 당-인산 골격은 두 가닥의 바깥쪽 (외측)에 있으며 안쪽 (내측)은 상보적 염기들의 수소결합으로 두 가닥을 결합시키고 있다. 염기 쌍은 A=T, G≡C 염기 쌍을 형성한다 (퓨 린 + 피리미딘 = 2개고리 + 1개고리).

24 DNA의 물리적 특성 염기 쌍의 거리는 3.4 Å로 1회전에 10bp로 구성. 염기 쌍 간의 각도는 36⁰ 이다.
염기 쌍은 대칭축에 수직으로 위치한다. 염기는 당 (Sugar)의 1번 탄소에 N-glycosidic bond로 연결되어 있다 (C1-N1, C1-N9). 외측에 2개의 홈 (대 홈,소 홈)을 갖고 있다. 이 홈에 Histone, Non-histone 단백질이 결합하고 있다.

25 DNA의 물리적 특성 두 가닥은 역 평행구조를 갖는다(Antiparallel).
P - 5’ - Sugar - 3’ – OH (5’→3’). OH - 3’ - Sugar -5’ – P (5’→3’). ※Single strand DNA (SS DNA) : M13, fd phage

26 DNA의 화학적 특성 생물체의 염기조성 [A] = [T] [G] = [C] ∴[A+G] = [C+T]
[A+T] : DNA 종류에 따라 일정하지 않음. [G+C] (세균의 경우 0.37~3.16까지 다양함) . GC content (GC 함량) : 고등생물은 거의 차이가 없음 (영장류: 0.49~0.51). 하등생물 : 세균분류에 이용함 (Clostridium : 0.27, Sarcina : 0.76, 대장균 : 0.5). [G+C] 전체염기

27 CsCl 용액 내에서 DNA 밀도: GC 함량과 연관

28 DNA의 특성 Very flexible (Fragility) : Pipetting 작업 시 절단되기 쉽다.
(동,식물의 경우 1% 정도 완전한 형태임). DNA 분자의 크기를 나타내는 단위 분자량 : Dalton (D), Megadalton (Md). 염기쌍수 (Base pairs) =106 dalton. 길이 : um (1 um = 2 Md = 2*106 dalton). DNA 구조의 결정요인 : Base stacking. Base pair : Hydrogen bond.

29 DNA 분자 크기

30 DNA 변성 : Denaturation Double strand DNA (ds DNA)
Denaturation Renaturation(재생) (변성) ① Heating. ② Alkali 처리. ③ 변성제. ④ Helicase 처리. Single strand DNA (ss DNA)

31 용해곡선 : Melting Curve 온도변화에 따른 DNA 분자의 변화를 나타냄. DNA : A260의 자외선 파장 흡수.
Buffer 1 ml에 1 ug의 ds DNA 용해되었을 때. A260 = ∴ 50 ug 용해되었을 때는 1.0 임. 50 ug/1 ml 일 때, ds DNA A260 = 1.0 (흡 광 감소 성: Hypochromic). ss DNA A260 = 1.37. Nucleotide A260 =1.60 (흡 광 증가 성: Hyperchromic). A260의 흡수력 : Nucleotide > ssDNA > ds DNA.

32 용해곡선 : Melting Curve

33 용해온도 (Melting Temperature : Tm)
용해온도 (Tm) : A260 의 최대값을 나타내는 온도의 ½에 해당하는 온도. 생 세포가 자연상태에서 접하는 온도보다 훨씬 높은 온도에 이르기 전까지 A260은 일정하다. A260의 증가는 6~8℃ 범위 내에서 일어난다. A260의 최대값은 최초의 값보다 37% 더 높다. DNA의 구조적 특성을 밝히는 데 이용.

34 DNA 내 Hydrogen bond의 존재 GC 함량이 증가함에 따라 Tm 증가. Formamide : AT와 경쟁적 결합.
Urea : GC와 경쟁적 결합. 염기 쌍의 형성과 파괴가 가역적으로 진행될 수 있는 온도 아래에서 두 화합물 첨가한 후 Tm 값 측정. 처리하지 않은 DNA 용액의 Tm 값 측정. 처리한 DNA Tm < 미처리한 DNA Tm. => 결론 : DNA내 수소결합이 있다는 증거.

35 Tm과 GC 함량과의 관계

36 DNA 내 소수성 상호작용의 존재 Methanol : 약 용해성 물질.
Sodium trifluoracetate : 물질 주위의 수 막을 제거함. 두 물질은 소수성 상호작용을 감소시킴. 용해성이 낮으면 소수성 group형성: Tm 높음. 용해성이 높으면 소수성 group파괴: Tm 낮음. Methanol과 Sodium trifluoracetate 첨가 : Tm 낮아짐. =>결론 : 두 화학물질이 Tm 값을 감소시킨다는 것은 DNA내 소수성 상호작용이 있다는 증거.

37 NaCl과 트리 플루오르 아세트산 나트륨의 비교

38 염기중첩 : Base Stacking 물리적인 확인방법.
Optical Rotatory Dispersion (ORD: 광 회전 분산 법). Circular Dicroism (CD: 원 편광 이색 성). 소수성 상호작용을 약화시키는 화학물질을 부가하면 염기중첩은 사라진다. DNA를 가열하면, A260이 증가하는 동안에 염기중첩이 감소된다. 수소결합을 끊는 화학물질은 단일가닥 polynucleotide의 염기중첩에는 아무런 영향을 미치지 않으나 이중가닥 DNA의 염기중첩은 변성된 DNA에서 관찰될 수 있는 정도까지 감소시킨다.

39 염기중첩의 협동성

40 DNA 구조에 미치는 ion의 효과 - 전하로 하 전 된 PO3 : DNA 두 가닥 분리 (변성).
Buffer 용액의 염 농도 감소 : Tm 낮음. Buffer 용액의 염 농도 증가 : Tm 높음. 염이 없을 때 : 두 가닥 반발 (변성). 염이 있을 때 : 중화작용 (재생). ※증류수 내의 DNA : 18~20℃에서 변성됨. ※염 농도 0.2M 보다 높으면 Tm 증가. 염기의 용해성 감소, 소수성 상호작용의 증가, Na+ ion에 의한 음전하의 중성화.

41 양이온이 DNA에 결합한다는 증거 Nucleotide 분자량 : 330 dalton. Sodium ion (Na+) : 23 dalton. Cesium ion (Cs+) : 137 dalton. Na DNA Cs DNA NaCl 용액 내에서 DNA 분자량 CsCl 용액 내에서 DNA 분자량 =>결론 : NaCl과 CsCl 용액 내에서 DNA 인산기의 대부분이 Na+ 또는 Cs+ 이온과 결합함을 의미한다. = 0.75 = 0.75

42 DNA 분자구조의 동요 : Breathing 현상
포름알데히드 (HCHO) : 염기의 NH2와 수소결합 형성 (두 가닥 DNA 분리 : DNA 변성, Tm 값 감소). DNA 용액에 HCHO 첨가 : DNA 비가역적으로 변성. DNA를 3H2O에 용해 : DNA 비가역적으로 변성. =>결론 : DNA분자는 정적인 구조가 아니고 이중가닥 부위가 열리고 닫히는 동적인 구조임. 단일가닥 기포를 형성하는 현상 : Breathing 현상.

43 DNA 분자구조의 동요 DNA 사이의 수소결합이 항상 결합되어 있다면 (정적인 구조를 갖고 있다면), HCHO 첨가 시 Tm 값이 변하지 않음. Breathing 현상 : AT 염기 쌍에서 자주 발생.

44 변성과 가닥분리 과거에는 DNA가 길기 때문에 분리되지 않을 것으로 생각하였음.
변성되지 않을 것으로 생각 되었으나, 실제로는 변성이 됨. DNA 변성의 물리적 특성. 점성이 낮아짐. 편광의 회전력 감소.

45 나선불안정화 단백질에 의한 변성 나선불안정화 단백질 (Helix-destabilizing Protein).
용해 단백질 (Melting Protein). T4 phage 32 gene : 32 protein (DNA binding protein) - 일렬로 배열 : DNA 가닥 분리.

46 변형된 DNA의 구조

47 염의 농도에 따른 DNA 구조 저 농도의 염 (0.01M 이하) : 90℃에서 완전 변성.
Cooling (냉각) : ds DNA로 전환 (재생). DNA 농도와 염의 농도 높을 때 :가닥 내 수소결합 증가. 알칼리 용액에서 DNA의 변성. ds DNA : pH 11.3에서 ss DNA (수소결합 파괴). ss DNA : pH 7.0에서 ds DNA (수소결합 형성). Heating에 의한 변성 시 phosphodiester bond (DNA 골격)가 파괴될 수 있어 DNA 변성시킬 때 Alkali 변성 법을 주로 사용함.