중합효소연쇄반응 (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) 중합효소연쇄반응 주형 DNA 분자의 특정 부분을 선택적으로 증폭 Primer set 와 내열성 DNA polymerase 를 이용하여 짧은 시간 내에 미량의 시료에서 Kary Mullis 1983 (1985) 1993, Nobel Prize in Chemistry
PCR 에 필요한 것들 주형 (Template) contain the DNA region (target) to amplify Primer set forward & reverse primer oligonucleotide complementary to the 3’ ends of each of the strand of the DNA target 내열성 DNA 중합효소 with a temperature optimum at around 70°C dNTPs Thermal cycler (PCR machine)
중합효소연쇄반응의 단계 Denaturation (DNA 변성 ) strand separation 94 ℃, 0.5 ~ 1 min Annealing ( 프라이머 결합 ) complementary pairing (Template – Primer) 55 ℃, 1 min (Temp. must be adjusted) Extension/Elongation (DNA 의 신장 ) Enzymatic DNA replication Heat stable DNA polymerase (Taq polymerase) 72 ℃, 1 min Initial denaturation : 94 ℃, 5 min Final Extension : 72 ℃, 5 min
Thermal cycler For repeated heating and cooling
After 10 cycles : 2 10 = 1, cycles : 2 20 = 1,048, cycles : 2 30 = 1,073,741,824
Applications of PCR 임상 (Diagnosis of diseases) 병원균의 감염 여부 ( 배양이 어렵거나 불가한 병원균 ) 유전병의 존재 여부, 유전자 돌연 변이 여부 암의 발병 진단 또는 발병 가능성 예측 DNA 증폭 및 정량 (Amplification and quantification) 법의학 (Forensic analysis) : Genetic fingerprinting 고생물학, 고고학 계통발생학적 분류 (phylogenetic tree) : 16S rDNA, 유전자의 발현 여부 및 발현 정도 결정 (Quantitative PCR, Real time PCR) 돌연변이 유도 위치지정 돌연변이 (Site-directed Mutagenesis) Error-prone PCR
Limitations of PCR 염기서열이 알려진 DNA 만을 증폭할 수 있음 Primer 제작에 필요함 Random primer Target DNA sequence 이외에 시료에 오염된 DNA 도 증폭 가능 1 분자의 DNA 도 증폭 가능함 염기서열이 바뀐 산물 생성 가능 Taq DNA polymerase : prone to error 유전자 원으로 사용할 경우 염기서열 확인 필수 Error-prone PCR for mutagenesis
DNA polymerase for PCR Klenow fragment of DNA polymerase I Heat stable DNA polymerases Taq polymerase (Thermus aqaticus) Relatively low replication fidelity Lack of 3' → 5' exonuclease proofreading activity Size limit : < 2 kb Pfu DNA polymerase : Pyrococcus furiosus proofreading activity Tth DNA polymerase : Thermus thermophilus Deep Vent TM DNA polymerase : Pyrococcus sp. Deep Vent TM (exo-) DNA polymerase : Pyrococcus sp.
Primers for PCR Primer set oligonucleotide Forward primer, Reverse primer 증폭 부위의 3’ 말단에 상보적이어야 함 Important design considerations Primer Length : 17 ~ 22 bp Primer G+C content : 40 ~ 60% Primer Melting temperature (T m ) Primer Annealing Temperature (T a ) Primary Secondary Structures : (X : Hairpin, Self dimer, Cross dimer)
Optimization of PCR Primer Length : 17 ~ 22 bp Long enough for adequate specificity Short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature 8-mer : primer 의 결합부위는 평균 4 8 = 65,536 bp 당 한 번 (human genome 3,2000,000 kb, 49,000 개 존재 ) 17-mer : 4 17 = 17,179,869,184 bp 당 한 번 (human genome 의 한 부위에서만 결합 )
GC Content : 40 ~ 60% Primer Melting Temperature (T m ) : 52 ~ 58 ℃ indicate the duple (DNA-DNA hybrid) stability critical in determining the annealing temperature Forward primer 와 reverse primer 의 T m 이 비슷해야 함 T m = (4 x [G + C]) + (2 x [A + T]) ℃ (nucleotide 의 개수 )
Primer Annealing Temperature (T a ) : Too high T a insufficient primer-template hybridization low PCR product yield Too low T a high number of base pair mismatches non-specific products (low PCR specificity) Determined experimentally Tm - (1 ~ 5 ℃ ) Opt. T a = 0.3 x T m (primer) T m (product) – 14.9
Primer Secondary Structures by intermolecular or intramolecular interactions Hairpin : intramolecular Self dimer : intermolecular, F-F, R-R Cross dimer : intermolecular, F-R adversely affect primer template annealing can lead to poor or no yield of the product
Cross-Dimer
Length of the Target 0.1 kb ~ 3 kb (~ 1 kb) ~ 10 kb, ~ 40 kb Buffer solution Bivalent cations : generally Mg 2+ is used Mn 2+ can be used for PCR-mediated DNA mutagenesis Monovalent cation potassium ion (K + )
Cloning of PCR products TA cloning Taq, Tth : PCR product 의 3’- 말단에 A 첨가 T vector 사용 제한효소 자리가 있는 primer 를 사용하는 방법 Primer 의 5’ 방향에 restriction site 를 가진 oligonucletide 가 결합된 primer PCR product 를 제한효소로 처리 후 vector 에 삽입 Topoisomerase 와 연결된 vector 를 이용하는 방법