18. Real-time PCR을 이용한 HBV DNA의 정량 4조 김기경 이규리
Real-time PCR이란? 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링 하여 해석하는 기술 ethidium bromide(Etbr)을 첨가하여, 이중나선 DNA의 양이 증가할 마다 형광 발광량이 증가하는 것을 CCD 카메라로 실시간 모니터하여 PCR 증폭곡선을 측정 * PCR : DNA의 염기서열 중 원하는 부분을 선택적으로 복제 중복시키는 기술
(1)DNA-binding dye를 이용한 real-time PCR 결합되는 염료의 형광 발산량이 증가 실시간 검출
(2) 형광표지 프로브를 이용한 real-time PCR TaqMan 프로브 5’-끝 : 형광보고자 결합, 3’-끝 : 형광흡수자 결합 exonuclease 활성 형광발산
(2) 형광표지 프로브를 이용한 real-time PCR 양 말단을 형광보고자, 형광흡수자를 결합시켜 헤어핀 구조로 제작하여 사용
Taqman HBV test 검체 DNA와 표준물질 DNA를 동시에 PCR하면서 실시간으로 측정되는 표준 DNA의 형광량을 이용하여 표준곡선을 구하고, 측정된 검체의 Ct 값을 보정하여 표준곡선에 대입함으로 HBV DNA를 정량
HVB DNA 정량검사 HBV DNA 정량검사: 결과 판독에 있어 신중한 검토가 필요한 검사 검사에 영향을 미치는 오류 1)형광물질의 관리(빛을 차단) 2)PCR시험관으로 사용되는 K-tube
Real-time PCR의 적용 대립인자 특이성 프로브를 이용한 SNP 분석 각 프로브는 TaqMan 프로브나 molecular beacons 프로브 방식으로 제작하여 사용
두 가지 프로브는 각각 두개의 대립인자, 혹은 두 가지 SNP에 특이적으로 결합 →PCR 중에 각 형광이 서로 다른 파장에서 측정됨 각 프로브는 SNP 위치의 단 하나의 염기 차이에 의하여 주형 DNA와 결합여부 결정
각 대립인자의 존재에 따라 PCR 순환반응 중에 증가하는 형광이 달라지게 된다.
※ 두 형광 물질의 RFU가 한 화면에서 구별되어 이형접합자인지 두가지 형광중 한쪽만 증가할때 : 동형접합 대립인자 두가지 형광이 동시에 증가 : 이형접합 대립인자 ※ 두 형광 물질의 RFU가 한 화면에서 구별되어 이형접합자인지 동형접합자인지를 쉽게 알 수 있음
2) ΔΔCT 을 이용한 상대적 정량 PCR 골수이식 성공 - 혈액검체에서 수용자의 대립인자 검출 X 대조 DNA와 환자의 대립인자의 CT의 차이 ΔCT - ΔCT는 골수 수용자의 세포가 골수이식 후에 얼마나 존재하느냐에 따라 비례적으로 관찰됨 골수이식 전 검체의ΔCT와 이식 이후 검체의 ΔCT의 차이 ΔΔCT - ΔΔCT값이 클 수록 골수 이식 이후 골수 수용자의 세포가 적게 남아 있다는것을 의미 ΔΔCT 방법은 유전자의 상대적 발현정도를 측정하는 데에 유용
감사합니다