Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods Toxicity & Toxicity Methods 2014.04.11. Fri. Jungsang Park

Contents 1. CTD 2. 신약개발의 특성 3. Toxicity 3.1. Abbreviation / Glossary 3.2. Outline of Toxicity 3.3. The ultimate purpose of toxicity testing 3.4. Examples of toxicity testing 4. Text book 정리 5. Acute Toxicity Test Organisms 6. Flow chart of Toxicity testing 7. 생식독성 8. 반복독성

CTD(common technical document) 우수한 의약품의 국제적인 연구개발 촉진을 위해 ICH(International Conference on Harmonization) 에서 승인심사자료의 국제적인 조화를 도모하기 위하여 합의(2001.6) 통일화한 표준문서양식. 허가신청시 제출자료의 구성을 나타낸 것으로 자료양식 및 순서에 관한 지침 제1부 신청내용 및 행정정보 1.1 제1부의 목차 1.2 제조판매품목허가신청 신고서 또는 수입품목허가신청 신고서 사본 1.3 품목허가신청 신고자료의 수집 작성업무를 총괄하는 책임자에 대한 정보 및 진술 서명자료 1.4 품목허가신청 신고자료의 번역책임자의 진술 및 서명자료 1.5 외국에서의 사용상황등에 관한 자료... 제2부 국제공통기술문서의 자료 개요 및 요약 2.5.1 제품개발배경 2.5.1.1 약리학적 분류 2.5.1.2 제품개발의 임상적․과학적 배경 2.5.1.3 임상개발계획 및 관련 가이드라인 2.5.1.3.1 본 적응증의 임상시험 2.5.1.3.2 사전상담 2.5.1.3.3 임상시험자료집 (clinical data package) 2.5.1.3.3.1 약물동태에 관한 임상시험자료… Common Technical document (CTD) 최근 우수한 의약품의 국제적인 연구개발 촉진을 위해 ICH에서 승인심사자료의 국제적인 조화를 도모하기 위하여 합의(2001.6) 통일화한 표준문서양식 허가신청시 제출자료의 구성을 나타낸 것으로 자료양식 및 순서에 관한 지침 ICH(International Conference on Harmonization) MedDRA (Medical Dictionary for Regulatory Activities) and the CTD (Common Technical Document).

CTD(common technical document) 원료의약품 3.2.S.1 일반정보 3.2.S.1.1. 명칭 3.2.S.1.2. 구조 3.2.S.1.3. 일반적 특성 3.2.S.2.제조 3.2.S.2.1. 제조자 3.2.S.2.2. 제조공정 및 공정관리 3.2.S.2.3. 원료관리 3.2.S.2.4. 주요공정 및 중간체관리 3.2.S.2.5. 공정밸리데이션 및 평가 3.2.S.2.6. 제조공정개발 3.2.S.3. 특성 3.2.S.3.1. 구조 및 기타 특성 3.2.S.3.2. 순도 3.2.S.4. 원료의약품의 관리 3.2.S.4.1. 기준 3.2.S.4.2. 시험방법 3.2.S.4.3. 시험방법의 밸리데이션 3.2.S.4.4. 뱃치 분석 3.2.S.4.5. 기준설정근거 3.2.S.5. 표준품 또는 표준물질 3.2.S.6. 용기 및 포장 3.2.S.7. 안정성 3.2.S.7.1. 안정성 요약 및 결론 3.2.S.7.2. 허가후 안정성시험 계획 및 이행서약 3.2.S.7.3. 안정성 자료

CTD(common technical document) 완제의약품 3.2.P.1. 완제의약품의 개요와 조성 3.2.P.2. 개발경위 3.2.P.2.1. 완제의약품의 조성 3.2.P.2.1.1. 원료의약품 3.2.P.2.1.2. 첨가제 3.2.P.2.2 완제의약품 3.2.P.2.2.1. 제제개발 3.2.P.2.2.2. 과다투입량 3.2.P.2.2.3. 물리화학적 및 생물학적 특성 3.2.P.2.3. 제조공정개발 3.2.P.2.4. 용기 및 포장 3.2.P.2.5. 미생물학적 특성 3.2.P.2.6. 적합성 3.2.P.3 제조 3.2.P.3.1. 제조자 3.2.P.3.2. 뱃치 조성 3.2.P.3.3. 제조공정 및 공정관리 3.2.P.3.4. 주요공정 및 반제품관리 3.2.P.3.5. 공정밸리데이션 및 평가 3.2.P.4 첨가제의 관리 3.2.P.4.1. 기준 3.2.P.4.2. 시험방법 3.2.P.4.3. 시험방법의 밸리데이션 3.2.P.4.4. 기준설정근거 3.2.P.4.5. 사람 또는 동물 유래 첨가제 3.2.P.4.6. 새로운 첨가제 3.2.P.5 완제의약품의 관리 3.2.P.5.1. 기준 3.2.P.5.2. 시험방법 3.2.P.5.3. 시험방법의 밸리데이션 3.2.P.5.4. 뱃치 분석 3.2.P.5.5. 불순물의 특성 3.2.P.5.6. 기준설정근거 3.2.P.6 표준품 또는 표준물질 3.2.P.7 용기 및 포장 3.2.P.8 안정성 3.2.S.7.1. 안정성 요약 및 결론 3.2.S.7.2. 허가후안정성시험 계획 및 이행 서약 3.2.S.7.3. 안정성자료

CTD(common technical document) 4.1 목차 4.2 시험보고서 4.2.1 약리자료 4.2.1.1 1차효력시험 4.2.1.2 2차효력시험 4.2.1.3 안전성 약리시험 4.2.1.4 약력학적 약물상호작용 4.2.2 약동학자료 4.2.2.1분석방법과 밸리데이션 보고서 4.2.2.2 흡수 4.2.2.3 분포 4.2.2.4 대사 4.2.2.5 배설 4.2.2.6 약동학적 약물상호작용 4.2.2.7 기타 약동학시험 4.2.3 독성자료 4.2.3.1 단회투여독성 4.2.3.2 반복투여독성 4.2.3.3 유전독성 4.2.3.3.1 생체외 시험 4.2.3.3.2 생체내 시험 4.2.3.4 발암성 4.2.3.4.4.1 장기발암성시험 4.2.3.4.2 단기 또는 중기발암성시험 4.2.3.4.3 기타시험 4.2.3.5 생식발생독성 4.2.3.5.1 수태능과 초기배발생시험 4.2.3.5.2 배태자발생시험 4.2.3.5.3 출생전후발생 및 모체기능시험 4.2.3.5.4 새끼에 투여하고/또는 더 평가한 시험 4.2.3.6 국소내성시험 4.2.3.7 기타독성시험 4.2.3.7.1 항원성시험 4.2.3.7.2 면역독성시험 4.2.3.7.3 기전독성시험 4.2.3.7.4 의존성 4.2.3.7.5 대사체 4.2.3.7.6 불순물 4.2.3.7.7기타 4.3 참고문헌

CTD(common technical document) 5.1 목차 5.2모든임상시험보고서의 도표로 된 목록 5.3 임상시험보고서 5.3.1 생물약제학 5.3.1.1 생체이용률 5.3.1.2 비교생체이용률과 생물학적동등성시험 5.3.1.3 in vivo/in vivo correlation 5.3.1.4 임상시험의 생물학적방법과 분석법 5.3.2 인체시료를 이용한 약동학관련시험 5.3.2.1혈장단백결합시험 5.3.2.2간대사와 약물상호작용 5.3.2.3기타생체시료를 이용한 시험 5.3.3 PK시험보고서 5.3.3.1건강한피험자 PK와 최초내약성시험 5.3.3.2환자PK와 최초내약성시험 5.3.3.3내인성요인PK시험 5.3.3.4외인성요인PK시험 5.3.3.5 집단약동학시험 5.3.4 인체약력학시험 5.3.4.1 건강한피험자에서 PD와 PK/PD시험보고서 5.3.4.2 환자 PD와 PK/PD시험보고서 5.3.5 유효성과 안전성시험보고서 5.3.5.1대조군을 이용한 비교임상시험 5.3.5.2비비교임상시험 5.3.5.3 1개이상의 시험에서 얻은자료분석 5.3.5.4 기타 다른임상시험 보고서 5.3.6 시판후 경험에 대한 보고서 5.3.7 증례보고양식과 개별환자목록 5.4 참고문헌

신약 개발의 특성 돈 먹는 하마인가 ? 황금알을 낳는 거위인가 ? High & Long Term Investment 돈 먹는 하마인가 ? 황금알을 낳는 거위인가 ? High & Long Term Investment Costs : 300~700M U$ /product Time : 10~15 years High Risk Success Rate : 0.02% (Discovery/Preclinical 5000  Clinical 5  Approval 1) High Return Peak Sale : 3억~86억 U$ /year Lipitor (Pfizer) 은 2005년에 129억$ (13조원)의 매출 Patent Protection : 출원 후 20년까지 (generally, 8~12 years after approval) 1990년에 Colorado 대학의 Larry Gold 연구팀에 의해 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후 계속 upgrade 중, 이 방법을 이용하여 특정 분자에 높은 결합력을 갖는 핵산 압타머를 얻게 된다 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 “chemical antibody”라고도 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성

Drug Discovery process 신약 개발의 특성 Drug Discovery process 돈, 시간, 과학/기술 너무 많이 필요한 작업 따라서 산업적인 측면에서의 신약개발은 discovery 단계에서 신약 개발을 하는데 까지 돈을, 시간을 얼마나 효율적으로 사용할 수 있도록 과학을 적용시킬 것인가? 그림에서 보는 바와 같이 screening은 최종적으로 신약이 된 물질이 어떤 작용을 하는지에 대한 정보를 얻는 과정인 반면에, 물질들을 떨어뜨리기 위한 tool 때문에 비용과 시간 중요도 측면에서 어떤 screening(약효/ADME/Tox)을 어느 단계에서 하는 것이 합리적인가?

Abbreviation / Glossary GLP / non-GLP(good laboratory practice) PK/PD correlation Therapeutic index(Margin of Safety, Safety margin) TK(Toxicokinetics) MTD(Maximum tolerated dose) NOAEL(No-observed-adverse-effect level) NOEL(No-observed-effect level) DRF(dose range finding ) Dosing regimen AMES(in the early 1970s by Bruce Ames and his group) CA(chromosomal aberration) MN(Micronucleus) Acute toxicity Chronic toxicity Cytotoxicity Carcinogenicity Genotoxicity GTi(Genotoxic impurities) ADI(acceptable daily intake(dose)) TDI(tolerable daily intake(dose)) MRSD(maximum recomended starting dose; 최대추천초기임상용량) LOAEL(lowest-observed-adverse-effect-level) RfD(Reference dose) BMDL10(benchmark dose lower confidence limit for a 10% response) FDA Guideline/guidance EMEA

The lower the LD-50, the more toxic the substance. Outline of Toxicity The lower the LD-50, the more toxic the substance. Some LD-50’s: Sodium Chloride- 4000 mg/kg 2,4-D (weed killer) 368 mg/kg DDT 135 mg/kg Caffeine 127 mg/kg Nicotine 24 mg/kg Strychnine sulfate (rat poison) 3 mg/kg Botulinum toxin 0.00001 mg/kg 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DDT(Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane) Botulinum toxin (보톨리누스 균이 만드는 toxin)

Outline of Toxicity “All substances are poisons: there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison from a remedy.” (16세기 스위스의 연금술사 Paracelsus) Hormesis 인간이 “적절한” 스트레스나 “적은 량”의 독소에 “간헐적”으로 노출되면 그로 인해 더 큰 스트레스에 저항력이 생기는 긍정적인 효과가 나타난다는 이론 과도한 량에 노출되면 독으로 작용하지만 몸이 견딜 수 있는 적당량에 노출되면 생물학적으로 건강에 도움이 된다는 의미 Example Thalidomide(in Europe in 1956 as a sedative-hypnotic and to reduce N/V of pregnancy.) Diethylstilbestrol(Synthetic nonsteroidal estrogen) Viracept® (nelfinavir mesylate, HIV protease inhibitor marketed by Roche in EU) 약물이 태반을 통과하여 태아로 간 후 오랜 세월을 지나서 병을 일으키는 예가 있습니다. 과거에 유산 예방 목적으로 썼던 합성 난포 호르몬의 일종인 DES(diethylstilbestrol)이라는 약을 임신 중 먹고 오랜 세월이 지난 후 문제가 되어 나타났는데, 예로 약물을 먹은 임신부가 딸을 출산하면 그 딸이 7-29세 때에 질이나 자궁 등 여성 생식기에 발육 이상이나 양성 질환인 질 선증(질의 피부가 분비선 세포로 변하는 질환)이 생기며, 질 선증이 있던 곳에서 드물게(0.14-1.4%) 악성인 선암(腺癌)이 생기기도 합니다. 또 아들을 낳으면 성기나 정자에 이상이 생기기도 합니다. 미국에서는 과거 임신 초기에 이 약의 사용으로 지금도 그 자녀에서 문제가 되고 있으며, 이 약을 쓴 산모에서 태어난 아이는 DES baby라고 하여 특별 관리하고 있는데, 우리나라에서는 이 약을 투여하지 않아 발견된 예는 없습니다. Formed from reaction between residual ethanol and methylsulfonic acid counter ion CH3SO3H + C2H5OH → CH3SO3C2H5 • EU marketing authorization reinstated in October, 2007 • Contamination problem resolved • Roche was requested to conduct toxicity studies to better assess risk to exposed patients

Outline of Toxicity hERG 관련 issue

Outline of Toxicity CYP 관련 Issue CYP2D6 : CYP - cytochromeP450, 2 – genetic family, D – genetic subfamily, 6 – specific gene

Outline of Toxicity CYP 관련 Issue

The ultimate purpose of toxicity testing 왜? ADME/Tox 에 관심을 갖는가? 왜 중요한가? 신약 개발  Clinical phase I, II, III 에서 좋은 결과  preclinical study에서 우수한 결과  Drug discovery 단계에서 potent한 candidate 확보  가능성 높은 heat/lead 도출 모든 독성시험의 가장 중요한 목적은 POD(point of departue)를 얻는 것이다. POD이란 인체노출안전기준를 설정하는데 필요한 동물의 독성시험에 얻은 독성지표라고 할 수 있다. Ex> ADI(acceptable daily dose)와 TDI(tolerable daily dose)를 얻는 공식은 NOAEL(또는 NOEL, LOAEL) / UF(uncertainty factor)인데 여기서 NOAEL이 POD가 된다. NOEL  NOAEL  BMDL10 자원의 효율적 사용 In vivo ⇔ In vitro GLP study ⇔ non GLP / Screening toxicity test BMDL10 (benchmark dose lower confidence limit)

Examples of toxicity testing 수태능 및 초기배 발생시험(Seg I)(Fertility study) 배·태자 발생시험(Seg II)(Embryo-fetal development study) 출생전·후 발생 및 모체기능시험 (Seg III)(Pre-and postnatal study with rat)

Examples of toxicity testing Study Price (USD) Method Validation Studies Formulation Validation in hERG vehicle $22,000 Formulation Validation $25,000 TK method validation in Rat plasma $30,000 TK method validation in Dog plasma $22,500 Sub total $99,500 Toxicology Studies Acute IV Toxicity in Rats (GLP) $28,800 IV MTD + DRF in Dogs + TK, Organ Weight, 8 major tissues histopath (GLP) $58,800 28-Day IV Toxicity Study in Rats with a 14-Day Recovery Period (8 timepoints TK) $220,700 28-Day IV Toxicity Study in Dogs with a 14-Day Recovery Period (8 timepoints TK) $223,100 Sub totalCombined $531,400 Safety Pharmacology Studies CNS & Respiratory study in Rats $48,500 CV study in non-naïve Dogs (with one day formulation) $65,700 hERG assay $18,400 $132,600 Genetic tox studies Ames test $8,700 in vitro CA test in CHO $32,200 in vivo MN + Comet test in Rats (both sexes) $47,600 Formulation method transfer valdiation for genotox studies $12,100 $100,600 Grand TOTAL $864,100 -5.5% discount -$47,525 FINAL TOTAL $816,575

Text book 정리 In Silico Toxicity methods In Vitro Toxicity Assays DDI hERG Block Assay Mutagenicity/Genotoxicity i) MN Assay ii) CA Assay iii) Comet Assay iv) Ames Assay v) Thymidine Kinase Mouse Lymphoma Cell Assay vi) HPRT Chinese Hamster Ovary Cell Assay vii) GADD45a-GFP Genotoxicity Assay Cytotoxicity i) MTT Human Hepatotoxicity Assay ii) Lactate Dehydrogenase Assay iii) Neutral Red Assay 살아있는 세포에 MTT를 처리하게 되면, MTT가 미토콘드리아에 있는 reductase에 의해 환원되어 formazan이라 불리는 crystal을 형성. 죽은 세포에서는 미토콘드리아가 이미 깨져 없기 때문에 reductase도 존재하지 않음. 따라서 formazan도 형성되지 않습니다.(yellow  purple)

Text book 정리 Teratogenicity:Zebrafish Model Selectivity Screens Reactivity Screens i) Glutathione Trapping ii) Covalent Protein Binding 3) In Vivo Toxicity Assays Discovery In Vivo Toxicity Preclinical and Clinical In Vivo Toxicity Biomarkers of In Vivo Toxic Responses i) Toxicometabonomics ii) Toxicoproteomics iii) Toxicogenomics Zebrafish, 발생생물학의 모델로서의 장점: 1) 척추동물이다 2) 한세대의 길이가 짧다(2달) 3) Embryo의 발생기간이 짧다 (24시간) 4) Embryo의 형성이 체외에서 이루어진다. 5) 투명하기때문에 관찰이 용이하다 6) 상대적으로 쥐나 개구리등에 비해 비용이 적게든다. 7) 상대적으로 쥐나 개구리등에 비해 많은 양을 다루기 쉽다

In Silico Toxicity methods 선택적 투과 ·보유효과(Enhanced Permeability and Retention Effect) : 신체내의 정상조직은 정상세포들의 규칙적인 배열로 인하여 매우 치밀하지만 암조직은 매우 빠른 세포분열을 통해서 생긴 조직이므로 치밀하지 못하여 적당한 크기(나노)의 고 분자가 많이 축적되는 현상을 말한다 Dendrimers are artificial macromolecules with tree-like structures. They are hyperbranched and monodisperse threedimensional molecules with defined molecular weights and hosteguest entrapment properties high uptake into HeLa cell and ID8 murine cancer cells, respectively through interaction between biotin and the SMVT Bioconjugation of biotinylated PAMAM dendrons to avidin HeLa사람의 자궁경부암 조직에서 얻어낸 세포, ID8 murine cancer cell

Acute Toxicity Test Organisms Use of test species based on Lab hardiness Common Known life cycle Cheap Short-lived 선택적 투과 ·보유효과(Enhanced Permeability and Retention Effect) : 신체내의 정상조직은 정상세포들의 규칙적인 배열로 인하여 매우 치밀하지만 암조직은 매우 빠른 세포분열을 통해서 생긴 조직이므로 치밀하지 못하여 적당한 크기(나노)의 고 분자가 많이 축적되는 현상을 말한다 Dendrimers are artificial macromolecules with tree-like structures. They are hyperbranched and monodisperse threedimensional molecules with defined molecular weights and hosteguest entrapment properties high uptake into HeLa cell and ID8 murine cancer cells, respectively through interaction between biotin and the SMVT Bioconjugation of biotinylated PAMAM dendrons to avidin HeLa사람의 자궁경부암 조직에서 얻어낸 세포, ID8 murine cancer cell

Flow chart of Toxicity testing Preclinical study also demonstrated that NKTR-102 has a superior anti-tumor effect in a colorectal cancer model In the phase I clinical trial, the pharmacokinetics and anti-tumor activity of NKTR-102 were evaluated in patients who have failed the prior standard treatment NKTR-102 exhibited a prolonged half-life in the plasma for 50 days, compared to 47 h of the free irinotecan formulation. Thirty-eight percent of the patients showed a significant or partial response. Moreover, the response was observed in various tumor origins including breast, ovarian, and cervical cancers

생식독성 수태능 및 초기배 발생시험(Seg I)(Fertility study) 배·태자 발생시험(Seg II)(Embryo-fetal development study) 출생전·후 발생 및 모체기능시험 (Seg III)(Pre-and postnatal study with rat)

반복독성

Problems On what are the currently most successful in silico tools for toxicity prediction based? Structural rules decided by expert committees and QSAR models. What are in silico toxicity tools useful for? An indication or alert to potential toxicity problems that can be followed up experimentally. What does the PXR assay test? CYP3A4 induction. What method other than PXR can be used for this? Test the activity of each isozyme before and after incubation with the test compound. If the activity increase with test compound treatment, the compound induced the enzyme. Which of the following compounds damage DNA?:(a) enzyme inducers, (b) cytotoxic, (c) mutagenic, (d) potentially carcinogenic. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DDT(Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane) Botulinum toxin (보톨리누스 균이 만드는 toxin)

Problems In the following table, link the assay with the observed end point: The LDH assay works by of the following mechanisms?: (a) uptake by healthy cells is detected colorimetrically, (b) LDH is taken up into the cells and reacts in the mitochondria to form a detectable product, (c) lysis of unhealthy cells releases enzymes that are detected with a biochemical assay. Assay DNA fragments more faster in gel electrophoresis than normal DNA Abnormally divided DNA is observed by microscope Reversion mutations allow colonies to grow without histidine Unusually shaped chormosomes Normal mammalian cells mutate so TMP does not kill them Micronucleus O Chromosomal aberration Comet Ames TK mouse lymphoma 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DDT(Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane) Botulinum toxin (보톨리누스 균이 만드는 toxin)

Problems Teratogenicity can be determined using what? Microscopic examination of embryos from rodents or zebrafish. What compound is used to trap reactive metabolites? Glutathione What toxicity studies are always performed prior to human phase I dosing? Animal dosing studies to determine maximun tolerable dose, such as acute dose, chronic dose(e.g., 2 weeks), safety pharmacology with histology. In vitro genotoxicity/mutagenicity studies, such as Ames, micronucleus, and chromosome aberration. What newer “-omics” methods have much potential for future toxicity studies? What do these assays measure? Toxicometabonomics (measures changes in normal endogenous biochemical intermediates); toxicoproteomics (measures changes in protein expression); toxicogenomics (measure changes in mRNA expression) 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DDT(Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane) Botulinum toxin (보톨리누스 균이 만드는 toxin)

감사합니다.