The SOS DNA repair system in E. coli

Error-prone (SOS) bypass DNA 손상 부위 복제시 => 손상 부위 복제하지 않고 뛰어 넘는 bypass 함.

uvrABCD의 T=T dimer 제거기전

8.5. Mutant Selection (돌연변이균주 선발법) Mutants rare, difficult to isolate 2가지 방법이 있다 Direct selection: 배지에서 돌연변이 균주만 성장하게 함. E.g., antibiotic-resistant mutants exposed to antibiotic Indirect selection: auxotroph로 선발한다 Auxotroph와 parent가 모두 자라므로 선별이 어려움. Replica plating 방법으로 극복함. Streptomycin- sensitive cells Streptomycin- resistant mutant Streptomycin- resistant mutant (looks the same as other colonies) Streptomycin- resistant mutant Medium containing streptomycin Medium without streptomycin

8.5. Mutant Selection (Auxotroph 선발법) Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Cells adhering to the velvet are transferred to the sterile media, resulting in exact replicas of the original plate. A plate of bacterial colonies is pressed onto the surface of sterile velvet. 돌연변이시킨 총균주 Colonies imprinted on velvet Sterile velvet Pressed onto sterile velvet Auxotroph Plates incubated 안자란다! (이것이 auxotroph) Pressed to velvet 3 Autotrophic mutants form colonies on the nutrient agar but not on the glucose-salts agar. 1 2 완전배지 완전배지 최소배지 (포도당-염 배지)

8.5. Mutant Selection (페니실린 처리법) Penicillin처리하여 mutant균주를 증균시킴. auxotroph의 비율이 높아짐. 완전배지 (돌연변이 포함) PC처리하여 배양함 PC제거 완전배지 완전배지 (Auxotroph 비율이 높다) Auxotroph (적색)

8.5. Mutant Selection (에임스 테스트) Carcinogen 검출법 (의약품, 화장품, 식품첨가물 등) 발암물질: 암유발 동물실험의 단점: 고비용, 장시간 소요. Ames test 돌연변이 균주가 parent 균주로 reversion되는지를 시험함. Salmonella auxotroph (his-) Uses direct selection 화합물이 mutagenic 이면 복귀비율이 증가함. Rat liver extract를 첨가함 (대사산물이 발암물질일수도 있기 때문) 발암으로 추정되면 다양한 시험법 실시.

8.5. Ames test His–균 발암의심 물질 첨가 최소배지 최소배지 최소배지 발암물질 비발암물질 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Control plate Test plates 최소배지 발암의심 물질 첨가 Incubation Most remain His– and do not grow Spontaneous His+ revertants Liquid without suspected mutagen Bacteria requiring histidine for growth (His–) Glucose-salts agar (lacks histidine) His–균 Many His+ revertant colonies 발암물질 최소배지 최소배지 비발암물질

Horizontal Gene Transfer (균끼리 유전자 전달) Mixture Strain A : His– Trp – Strain B: Leu – Thr – 최소배지 최소배지 최소배지 (Recombinant 만 자람) Auxotroph끼리 유전자 주고받아 recombinant 생김 : horizontal gene transfer E.g., His–, Trp– with Leu–, Thr–

Horizontal Gene Transfer의 3가지 기전 Transformation - 형질전환 - naked DNA uptake by bacteria Transduction - 형질도입 - Viruse 개입하여 유전자 전달 Conjugation - 접합 - DNA transfer between bacterial cells

Horizontal Gene Transfer (b) Integrated DNA fragment DNA fragment (no origin of replication) Homologous recombination (a) Non-integrated DNA fragment Ori: Replicon이 복제원점 있으면 복제함. 예:Plasmids, chromosomes Homologous recombination: DNA fragment의 염색체내 삽입시 서열 유사해야 함.

8.6. DNA-Mediated Transformation + No effect Mouse dies Living encapsulated cells isolated Heat-killed Living cells Organisms injected Results Griffith’s Genetic Transformation Naked DNA: 세포내 또는 바이러스내에서는 존재하지 않음. 세포파괴시 분비됨. Dnase첨가시 형질전환 안됨. 형질전환: 폐렴쌍구균의 실험 캡슐 소유균만 독성발현.

8.6. DNA-Mediated Transformation 1 2 3 4 5 Gene Conferring StrR Single strand enters Homologous Recombination StrS DIe Multiply Multiply 형질전환(Transformation) Recipient cell은 반드시 competent 상태되야. Ori 소유와 관계없이 세포내 이동 일부 세균은 서열이 비슷한 DNA만 흡수함. 엄격한 통제를 거침. Bacillus subtilis 의 감응조건 N, C의 저농도 감지 고농도세균시 작동 (quorum sensing) 일부균만 competent 돌입.

Competent cell CaCl2로 competent cell 제조법 (감응세포, 능력세포) DNA를 세포내로 받아들일 수 있는 상태의 세포 실험실에서는 CaCl2를 처리하여 만든다. 요즘은 미리 만들어 제품으로 판매하고 있다. CaCl2로 competent cell 제조법

8.7. Transduction (형질도입) Transduction: Bacteriophage가 유전자 전달 5 3 4 1 2 8.7. Transduction (형질도입) Transduction: Bacteriophage가 유전자 전달 Generalized transduction: A세균 유전자를 B 세균에 전달 Specialized transduction: (A세균 유전자+ 바이러스 유전자)를 B 세균에 전달 Transducing particle (a) Formation of a transducing particle

Generalized transduction A세균 유전자를 B 세균에 전달 A세균 B세균

8.8. Conjugation (접합) Conjugation: 두 세균이 접촉하여 유전자 전달 Donor와 recipient cell의 접촉이 필요함. Conjugative plasmid의 유전자를 전달함(Replicons) F plasmid (fertility) of E. coli most studied Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. F pilus 2 µm

8.8. Conjugation Conjugation (continued…) F plasmid of E. coli 한가닥 절단 전달시작 양측 F+ 됨 Conjugation (continued…) F plasmid of E. coli F+ cells have, F– do not F인자 전달과정 Sex pilus 형성 접촉시작 Enzyme cuts plasmid Single strand transferred Complementary strands synthesized Both cells are now F+

8.8. Conjugation 염색체 DNA 전달: 흔치 않음 Hfr (high frequency of recombination)로 염색체 DNA를 전달 F 인자가 homologous recombination으로 염색체에 들어가면 Hfr 세포가 됨. 이과정은 가역적임. Hfr 세포에서 F인자가 나오면서 염색체 일부를 가지고 나오면 F’인자 가 됨. Formation of an Hfr cell Hfr cell F+ cell Integrated F plasmid an F′ cell F′ cell F′ plasmid

염색체 DNA 전달(continued…) B C c ′ 3 1 Making contact Origin of transfer Donor cell Hfr Recipient cell F– Transfer ends Transferring DNA Integration of transferred DNA Hfr cell F– cell Chromosome Integrated F plasmid 염색체 전달 순서 F pilus 생성 Donor의 plasmid origin of transfer에서 전달시작 염색체 유전자가 recipient cell로 이동됨. 대개 염색체의 일부만 전달됨 (전체는 100분정도 소요) Recipient cell은 여전히 F– 임.

8.9. The Mobile Gene Pool(이동성 유전자) 유전체학(Genomics) 연구결과 동일종에서도 유전자 종류가 동일하지 않음을 발견 예: E. coli 에서도 75% 유전자만이 모든 대장균에 존재함=> 이것을 core genome 이라함. 나머지 25%는 이동유전자(mobile gene pool)라 함. 예: Plasmids, Transposons, Genomic islands, Phage DNA

이동유전자

8.9. The Mobile Gene Pool Plasmid는 Bacteria, Archaea, 일부 Eucarya에 존재함. 대개 복제원점을 가진 dsDNA임. 생존 필수성분 아님: cure(제거)할 수 있음 각종 유전자가 들어있음 Low-copy-number: One or a few per cell High-copy-number: Many, perhaps 500 대개 host range가 좁다 일부 플라스미드는 broad host range임. Includes Gram(–) and Gram(+)

플라스미드 유전자

GMO 옥수수 제조법(예 Bt gene 삽입) (http://www.scq.ubc.ca/bt-corn-is-it-worth-the-risk/)

Bt toxin Mechanism (http://web.utk.edu/~jurat/Btresearchtable.html)

Bt-Toxins Found In Newborns Causing Food Allergies To Autism May 27, 2011 /NewsRelease/ - Bt-toxins were causing leaky gut syndrome in newborns, and the passage of undigested foods and toxins into the blood from the intestines causing devastation. Scientists speculate that it may lead to autoimmune diseases and food allergies. Furthermore, since the blood-brain barrier is not developed in newborns, toxins may enter the brain causing serious cognitive problems. Some healthcare practitioners and scientists are convinced that this is the apparent mechanism for autism.(http://nutritiondietnews.com/854063/) Monsanto’s BT-toxin Found in the Blood of Pregnant Women and their Babies (http://ebookcashstreams.com/HotNewsBlog/2011/07/monsantos-bt-toxin-found-in-the-blood-of-pregnant-women-and-their-babies/) Monsanto’s Bt corn: 다양한 면역이상 (IgE and IgG 상승, 알러지, 감염) Bt-toxin 식품을 마우스 식용: 조직손상과 면역반응이 cholera toxin만큼 강함. 인도의 Bt cotton 재배농부: 피부발적, 알러지, 감기증상 Bt cotton 농장 방목 소, 양, 염소: 때죽음 인간: 장내 미생물에 이미 Bt gene 발견됨.

야외체험 학습에 나섰던 자폐증 어린이가 산속에서 실종된 지 2시간여 만에 경찰과 소방서 직원들의 끈질긴 수색끝에 부모에게 인계됐다. Remember whose watching your back … Mon$anto owned USDA … FDA … CODEX … Congre$$ … $upreme Court … GMO causes: Endocrine disruption Damage to DNA Reproductive toxicity Developmental toxicity Neurotoxicity Cancer Birth defects Bt Toxin Kills Human Kidney Cell (http://authenticallywired.com/2012/03/03/remember-whose-watching-your-back-2/) “자폐증 성향 한국초등생 美-유럽의 2.6배” 증세보인 10명중 4명이 여자 일산지역 5만여 명 조사 (American Journal of Psychiatry, 2011) 일산: 야외체험 학습에 나섰던 자폐증 어린이가 산속에서 실종된 지 2시간만에 수색끝에 부모에게 인계. (경인일보 - 2012년 5월 3일)

8.9. The Mobile Gene Pool R Plasmid 내성 plasmid (R plasmids) 항생제와 중금속(mercury, arsenic)에 저항성. Often two parts R genes RTF (resistance transfer factor) Codes for conjugation Often broad host range Normal microbiota can transfer to pathogens R Plasmid Chloramphenicol- resistance gene Carbenicillin- Resistance gene Tet resistance gene Pilus- synthesis genes Origin of replication Origin of transfer

주사부위에 Crown gall tumor생성 8.9. The Mobile Gene Pool Bacteria can conjugate with plants 세균끼리 유전자 전달, 세균의 유전자를 식물에 전달. 자연적 genetic engineering의 일종임 Agrobacterium tumefaciens causes crown gall(왕관모양의 혹) Different properties, produces opine(종양), plant hormones 암유발 플라스미드(Ti)의 T-DNA (transferred DNA)가 식물에 전달됨. Non-homologous recombination으로 식물 염색체에 삽입됨. Agrobacterium tumefacions cell 주사부위에 Crown gall tumor생성 Plant DNA Ti plasmid T-DNA Plant tumor tissue Agar medium

8.9. The Mobile Gene Pool Transposon은 DNA 전이를 일으킴. 동일 세포내에서도 이동함. 최소전이단위는 insertion sequence (IS)임. IS부위에는 transposase enzyme만 들어있음, inverted repeats Composite transposon(복합트란스포손)에는 여러 개의 유전자가 들어있음. Non-homologous recombination으로 삽입됨.

Conjugation으로 Transposon 전달의 예 병원입원환자: 초기엔 vancomycin sensitive한 S. aureus 균에 감염 시간경과 후 각종 항생제로 치료안됨. Vancomycin에도 내성 생김. MRSA: methicillin resistant S. aureus VRSA: vancomycin resistant S. aureus 원인이 뭘까? 대변균 Enterococcus faecalis 의 transposon이 S. aureus 균에 전달됨. 즉, Transferred transposon- containing plasmid to S. aureus

8.9. The Mobile Gene Pool Genomic islands: 타세포의 유전자가 염색체에 삽입된 것 수평전달 다른 종에서 유래했다는 증거: 유입된 부분은 G-C 함량이 많이 다름. Genomic islands의 기능 Utilization of energy sources (에너지생성) Acid tolerance (내산성) Development of symbiosis (공생시작) Ability to cause disease (질병유발): Pathogenicity islands EMBO reports 2, 5, 376–381(2001)

Pathogenicity islands (병원성유발 유전자) 주로 분비성 독소(toxin) 유전자 예: Salmonella typhimurium Yersinia pestis Shigella flexerneri Pseudomonas aeruginosa 기전: 세균이 MΦ와 접촉시만 toxin분비 독소는 숙주단백과 유사해서 분해안됨. 숙주 MΦ내로 신호전달 차단. 숙주 면역기능 저하 세균증식 Salmonella 균의 소장침투 기전 (Salmonella균이 pathogenicity island 1(SPI1) 유전자를 발현하여 type III secretion system (T3SS)으로 침투가능해짐) (Nature Reviews Microbiology 6, 53-66 (2008)