Cell Viability 박 종 철 연세대학교 의과대학 의학공학교실

Cell의 Viability란 무엇인가? - 성장 - 증식 - 대사활성 등

Cell Viability의 측정 - 측정방법에 따라서 차이가 발생 : 각 측정법에서 별도의 정의를 사용 [예] Trypan blue 염색: 세포막의 integrity에 기초한 염색 형광염색: 세포내 효소의 활성에 기초한 염색 Isotope: 세포의 대사활성에 기초 - 종래의 방법 : (Macro) 성장, 증식 - 최근 시도되고 있는 방법 : (Micro) 성장, 증식, 대사활성, 세포막 손상 등

Cell viability 측정의 응용 - 조직공학 - 발효공학 - 독성학 - 위생학 (식품,환경 등) - 생명공학

Cell viability 측정 방법의 선택시 고려사항 - 신속성 - 정확성 (정량적) - 경제성 - 용이성

발효과정의 세포수 측정 시스템에 요구되는 특징 (by Dr. Matsunaga) - 응답이 빠르고, 연속적으로 측정이 가능 - 높은 감도 - 측정부분이 생물학적으로 불활성 - 시약을 첨가할 필요가 없음 - 비파괴적 측정법 - 광범위한 적용범위 - 수명이 길고, 저렴 - 혼탁한 시료라도 사용가능 - 멸균가능

Viability 측정 방법  검경법 (염색법)  생균수 측정법: 군집 (colony) 형성  흡광도, 탁도 측정법  일반적 효소활성 확인법: API ZYM  Isotope 사용법  형광염색법: FDA-PI  발광 확인법: Luciferin-Luciferase  극미약광 측정법  영상처리법  생물진동 확인법  막전위 측정법

 검경법 (염색법) - 세포수 측정법의 기본, 가장 일반적 - Haematocytometer를 사용하여, 세포농도를 구함 - 적당한 염색제를 사용하여 viability 측정이 가능 - 단점: 조작이 복잡하고 기술과 경험이 필요 106 cells/ml 이하의 세포농도에서 측정불가능 pH 변화: Neutral Red, Phenolphthalein 핵산의 염색: Acridine Orange, Ethidium Bromide 세포막 변형: Tryphan Blue 세포 mitochodria내의 효소 활성: MTT

Trypan Blue: an indicator of cell integrity Viable cell Dead cell Viable cells exclude acidic dye Blue stained Neutral Red: an indicator of lysosome integrity Viable cell Dead cell Neutral Red is endocytosed by vital cells and internalized inside lysosome Red Stained

: Cell viability by mitochondrial dehydrogenase MTT assay : Cell viability by mitochondrial dehydrogenase Insoluble colored formazen (product) MTT is converted to an insoluble colored formazan derivative which is then solubilized in acidic isopropanol Substrate (MTT) Substrate (MTT) Mitochondria Mitochondrial dehydrogenase Substrate (MTT)

 군집형성측정법 (Colony 계수법) - 생균수 측정법의 기본 - 피검액 일정량을 한천(agar) 배지와 섞어 배양하여, 생성된 colony를 계수. (Bateria) - 한천배지위에 일정량의 세포현탁액을 도말하여 배양한 후, 생성된 colony를 계수. (Fungi, Animal cell, Plant cell) - 선택 배지를 사용하면, 세포의 식별도 가능 - 세포수 측정한계: 1 cell/ml - 임상의학에서는 가장 일반적 - 단점: 죽은 세포의 계수가 불가능 측정에 장시간 (24시간 이상) 필요로함 시스템화가 곤란

Colony 계수법 Sample Determination of the number of colony Spreading of sample Plate with fresh agar Determination of the number of colony Culture

 흡광도, 탁도 측정법 - 총물질로 탁도를 측정하는 방법 세포내 함유된 특정물질을 추출하여 측정 - 세포농도의 탁도 측정에는 투과광과 산란광 고려 - 세포현탁액에 의한 산란광의 세기에 영향을 미치는 요인 : 세포농도, 크기, 형태, 세포성분 등 - 피검액이 일정하다면, 산란광의 세기는 총세포수에 대응 - 간편, 일정수주의 정밀도를 가짐 - 측정한계: 106 cells/ml - 단점: Cell viability 측정 불가 세포간 식별 불가 고형분을 함유한 검체의 정확한 측정 곤란 진한색의 배지 사용할 때 정확한 측정 곤란

 일반적 효소 활성 확인법 -API ZYM - 19 종류의 일반적인 지질, 단백질, 당 분해 효소의 활성 1. Phosphatase alkaline 2. Esterase (C4) 3. Esterase Lipase (C8) 4. Lipase (C14) 5. Leucine arylamidase 6. Valine arylamidase 7. Cystein arylamidase 8. Trypsin 9. Chymotrypsin 10. Phosphatase acid 11. Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase 12. -galactosidase 13. -galactosidase 14. -glucuronidase 15. -glucosidase 16. -glucosidase 17. N-acetyl--glucosaminidase 18. -mannosidase 19. -fucosidase

protein concentration and radio-labelled amino acids  Isotope 사용법 Principle: Cell must continually synthesize protein in order to remain viable Accumulation Incorporation Synthesis of protein 3H-Proline Viable cell Measurement of protein concentration and radio-labelled amino acids - 3H-Proline: generally used because it is not compete with other amino acids during transport within cell - 3H-thymidine: related with the number of cells replicating DNA as well as that of accumulated radiolabelled amino acids

Viable Cell F Non-viable Cell  형광 염색법: Assessment of Viability by Double-Staining Viable Cell PI Esterase FDA F 515 nm (Fluorescence) Non-viable Cell 620 nm 488 nm (Excitation) PI: Propidium Iodide FDA: Fluoresein Diacetate

前方散亂光 [ Scatter ] 螢光 [ Fluorescence ] Flow-Cytometry (FCM) Cell Suspension Laser-Beam 前方散亂光 [ Scatter ] 螢光 [ Fluorescence ] [- control] : non-staining Living cells Dead cells

 ATP 측정법 (Bioluminescence) - 세포내 특정물질의 광학적 측정법 - 세포중의 ATP는 성장과정, 배양조건에 관계없이 거의 일정 - 세포로부터 추출된 ATP와 반딧불의 Luciferin-Luciferase 반응  생성된 형광 강도를 측정 - 세포를 직접 탁도로 측정하는 것보다 감도가 높음 - 단점: 추출 조작등 복잡 (ATP 소실 가능성) 파괴적 측정 결과를 얻기까지 시간을 요함 (현재는 해결됨) 배지중의 ATP, 금속이온 등이 영향 죽은 세포의 측정이 불가능

- Firefly bioluminescence Luciferin + Luciferase + Mg2+ + ATP  Luciferyladenylate L-AMP L-AMP-luciferase + O2  Oxyluciferin*-luciferase Oxyluciferin*-luciferase  Oxyluciferin-Luciferase + Light (562 nm) - Bacterial luminescence Photobacterium phosphoreum, Vibrio harveyi Oxido reductase NAD(P)H + FMN FMNH2 + NAD(P) FMNH2 + Luciferase +O2  FMNH(OOH)•luciferase FMNH(OOH)•luciferase + RCHO  FMN + R•COOH + Luciferase H2O + Light

Principle of Bioluminescence Assay Method ATP Cell Lysis + Luciferin + O2 In the presence of Luciferase & Mg2+ AMP + CO + Pyrophosphoric Acid + Oxyluciferin + Luminescence (480 nm)

극미약광 발광 Mechanism  극미약광 측정법 - 광전자계수법에 기초하여, 고감도 발광검출장치로 측정 Noise를 줄이기 위하여 (진공) 냉각 방식을 채용 Liquid nitrogen CCD camera 사용 감도: 수개의 광자 (photon) / 10 sec 극미약광 발광 Mechanism 1. Chemiexitation 2. Superhelical DNA

1. Chemiexitation Mitochondria의 전자전달계에서 전자유출과 동시에 활성물질 (O2-, OH, O2*, H2O2, Fe2+/Fe3+)이 생성되어 Unsaturated fatty acid와 반응하여 singlet oxygen(O2*) 생성 O2*가 unsaturated compound (lipid, phospholipid, ubiquinone) 과 반응하여 chemiluminescent reaction

2. Superhelical DNA Supertwisted DNA가 복제를 위하여 relaxation될 때, gyrase DNA gyrase no ATP ATP G < 0 Positively supertwisted DNA Negatively supertwisted DNA relaxed Supertwisted DNA가 복제를 위하여 relaxation될 때, supertwist 9개당 -225kj/mol의 G가 발생하여, 이 energy로 극미양발광이 가능한 exited nucleotide 생성

극미약발광의 예 동물세포: 간장, 근육, 심장, 신경, 혈구세포 등 발광정도는 3-20분간 세포 1개당 1 photon 정도 파장은 400-700 nm 식물세포: 여러 식물이 발아할 때, Meiosis하는 세포로부터 극미약광의 변화 확인 (superhelical DNA가 원인으로 추측) Yeast (Saccharomyces cerevisiae) Logarithmic phase의 경우 UV파장이 많음 Stationary phase의 경우 가시파장이 많음 Budding할 때 발광이 강함

 막전위 (membrane potential) 측정법 - Transmembrane proton gradient pmf (proton motive force)를 가짐 pmf의 electrical component의 단위: mV - Bacteria에서 outward proton pumping 결과 Plasmic (inner) side: alkaline, electrically (-) relative to the periplasmic (outer) side - Mitochodria Matrix side of the inner memb: relatively alkaline, (-) -Chloroplast (thylakoid memb) 광합성중에 inward proton pumping outer side: alkaline, electrically (-)

- 막전위 측정 방법 micro-electrode injection: injection 위치 파악 곤란 dis-C3-5: 형광 merocyanin 540: 형광