임상미생물검사의 기본원칙, 그람양성 및 그람음성균 Dept. of Laboratory Medicine Prof. Hee Joo Lee Feb. 27, 2012

Chapter 48 검체 채취, 운반 및 접종 Chapter 49 임상미생물 검사 Chapter 50 그람양성세균 Chapter 51 그람음성세균 Chapter 52 무산소성 세균, 미산소성 세균 및 나선균

학습목표 검체별 채취 방법을 안다. 각 미생물별로 주요 감별점을 안다.

검체 채취, 운반 및 접종 검체의 채취 오염이 안되게 감염이 있는 바로 그 부위 채취시기가 중요 충분량의 검체 적당한 채취기구(dacron, polyester) : Stuart, Amies, Cary-Blair 등의 수송 배지, 혐기성 배양용 검체(주사기 흡인액), 검체 채취에서 부터 접종까지의 시간 단축 항균제 투여전 용기에 환자의 병록번호, 이름, 의뢰한 과, 병실, 검체의 종류 기록

검체별 채취방법 피부소독을 철저히 해서 상재균이 들어가지 않도록 혈액 : 피부소독을 철저히 해서 상재균이 들어가지 않도록 Iodophor, iodine tincture, chlorohexidine → 1분간 마르기를 기다린 후 채혈 혈액 10 mL를 호기성 배양용 배지(trypticase soy broth, brain heart infusion broth 등)와 혐기성 배양용 배지 (thioglycollate broth)에 접종 충분량 접종 오한이 나기 전이 좋으나 예측할 수 없으므로 열이 나면 바로 채혈하고 시간차이 없이 동시에 다른 부위에서 2-3회 채혈한다. 급성심내막염인 경우 S. aureus와 같은 병원성이 강한 균주에 의한 것이 많으므로 즉시 채혈 아급성 심내막염 30분 내지 1시간 간격을 두고 채혈

혈액 자동혈액 배양기 육안관찰 균성장관찰 → 계대배양

Cockerill, CID 2004

Clinical significance of Staphylococcus epidermidis

카테터 연관 혈관내 감염 (catheter-related blood stream infection) 반정량적 배양 Roll plate법 5 cm잘라서 4-5번 굴려서 배양 1회의 혈액 배양 양성, 팁 배양 15개 이상 : CRBSI 혈액 배양 음성이면 집락수에 관계 없이 : 집락화 중심 정맥관이나 venous access port (VAP) 추천 방법 2회의 혈액 배양 비교 (말초 혈액과 카테터 허브) 1) 동일 균종이 주심정맥관 혈액 배양에서 120분 먼저 배양시, 2) 5배 이상의 균수

척수액 L3와 L4 사이를 2% iodine tincture로 소독 세 개의 무균 시험관에 각각 2-5 ml 첫째나 둘째 시험관을 이용 채취한 즉시 검사실로, 지연시에는 실온 오염되지 않게 요 요도 주위를 비눗물로 씻은 다음 중간뇨 10 ml를 무균용기에 채취(midstream clean catch) 즉시 검사실로 지연시 냉장보관 105 CFU/ml 젊은 여성에서 증상을 호소하는 경우 102 CFU/ml도 감염으로 간주

비인두 검체: 인후 검체 : 운반 지연시 실온 보관 β-hemolytic group A str.(S. pyogenes): 인후염 Corynebacterium diphtheriae: Albert염색 Neisseria gonorrhoeae: modified Thayer Martin배지 후두개염 원인균 (H. influenzae type b, S. aureus, S. pneumoniae) 비인두 검체: S. aureus의 보균자 검출에 이용 농 주사기로 흡인 흡인하지 못하는 경우 : 수송배지 이용 체액: 오염 되지 않게 생식기 검체 무염색 표본: Trichomonas 임균, Clamydia trachomatis: 핵산증폭교잡법 등

하부기도검체 객담의 정도관리(Murray와 Washington의 변법) Group 100배 시야당 상피세포 백혈구 1 > 25 <10 2 10-25 3 4 5 6 1,2,3 : 부적합 검체 Mycoplasma, Mycobacterium, Legionella 검출시에는 객담의 질을 평가하지 않는다.

WBC Epithelial cell

기관지 보호솔질(protected specimen brush, PSB)과 기관지 폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BAL) 인공호흡기 단 환자, 면역저하환자의 폐렴의 진단 PSB: 기관지경을 통하여 cannula를 원하는 곳에 넣고 솔을 이용하여 검체를 채취(솔을 1mL의 액체배지나 식염수)하여 즉시 검사실로 보냄 BAL 기관지경을 통하여 140 mL 이상의 식염수를 3-4번에 걸쳐 주입 이중 일부를 30분 이내에 미생물 검사실로(지연시 냉장보관) 정량 배양은 진단의 특이도는 높지만 민감도는 양성결과로 선택된 기준치에 의해 결정

BAL검체에서 104 CFU/mL이상: 세균성 폐렴 PSB에서 103 CFU/mL 세균성 폐렴 분비물 내의 세균이 105-106 CFU/mL임을 의미 연속배수희석법 보정된 루프법

귀: 외이도염, Pseudomonas aeruginosa 눈: C.trachomatis 만성조직감염: Actinomycetes, Brucella, Mycobacterium, 진균 검체의 양이 충분해야

대변 검체 급성기에 채취한 설사변 1-2 g 정도를 채취 면봉을 항문 괄약근 위 1인치 정도 넣어 회전 Cary-Blair나 Stuart 수송배지 C. difficile 의심시 ; 독소검사 입원한지 3일 이후의 설사환자의 변은 : 일상적인 세균 배양은 실시하지 않고 C. difficile 검사 혐기성 세균을 위한 검체 산소에 노출되는 것을 막기 위해 CO2나 N2가스를 채운 시험관 주사기로 흡인시에는 공기를 배출시킨 후 고무마개를 통하여 검체를 병에 넣는다. 면봉사용시에는 환원시킨 혐기성 수송배지의 고층이용 Cary-Blair 등의 수송배지

일반 경검 현미경 Phase contrast microscopy Fluorescence microscopy Darkfield microscopy Electron microscopy 염색표본 Gram 염색 항산성염색 형광염색: auramine-rhodamine (mycolic acid와 친화성), Acridine orange, Calcoflour white 면역형광염색: fluorescein isothicyanate (FITC), tetramethyl rhodamine isothianate (TMRI) 단클론성항체 Lactophenol cotton blue

세균배양검사

혈청검사 Serologic tests 침강법 보체고정법 중화시험 응집법 효소면역분석법 항체검사 면역글로불린 검사: IgM: 현재 감염, IgG: 과거 감염, 면역 상태 IgG avidity test: 현재 감염을 진단하는 다른 방법 감염 초기에는 낮은 avidity, 두번째 감염에서는 강해지는 원리 Immuno-PCR, Rapid immuno assay

분자진단의 활용 진단 및 병원체 확인 세균 및 진균의 동정 질병의 예후와 진행의 확인 치료 반응 여부의 확인 병원감염의 확인 및 역학조사

그람양성 구균 Staphylococcus 통성 혐기성 그람 양성 구균 Coagulase positive : Staphylococcus aureus 임상검체에서 분리되는 균의 25%정도 피부감염, 중이염, 수술 후 창상 감염, 균혈증, 심내막염, 폐렴, 화농성 관절염, Scalded skin syndrome, toxic shock syndrome, 식중독 90% 이상이 penicillin 내성(β-lactamase 생성) Methicillin resistant S. aureus (mecA유전자) -PBP2a 생성- 세포벽에 β-lactam계 항균제가 결합하지 못함: 병원에서 분리되는 세균의 70% 정도 Glycopeptide-intermediate 또는 vancomycin-intermediate Sta. aureus

Coagulase negative Staphylococci (CNS) S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. warneri, S. saprophyticus 피부 상재균의 오염 여부 감별 중요

Coagulase test Gram pos. cocci, cluster

DNAse 양성 음성 Mannitol Salt Agar 양상

사슬알균Streptococcus Gram positive cocci 혈청학적 : 탄수화물 항원 Lancefield group A, B, C, G 용혈양상 : alpha, beta, gamma hemolysis Group A β- hemolytic streptococcus : 사구체 신염, rheumatic fever Group B β- hemolytic streptococcus : 신생아 패혈증, 수막염 Streptoccocus pneumoniae : 지역사회 폐렴, 수막염, 패혈증

Gram positive cocci, chain Serogrouping of Streptococcus

Streptococcus pneumoniae Gram pos. diplococci Optochin test

장알균 Enterococcus 그람양성 통성혐기성 구균 장내 정상 균무리 D군 연쇄상구균→Enterococcus 요로감염, 창상감염, 균혈증 고령자, 면역억제 환자 대부분의 항균제에 대한 자연내성 고농도 aminoglycopeptide에 내성을 보이는 균주 Glycopeptide에 내성을 보이는 균주(vancomycin resistant enterococci, VRE) Vancomycin 6 ug/mL 을 넣어서 만든 선택 배지에 접종 배양 및 동정 Catalase음성, BE, PYR 양성, 6.5%NaCl과 45oC에서 성장

Gram positive bacilli Corynebacterium Listeria monocytogenes C. diphtheriae, C. jeikeium Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Bacillus anthracis: 피부탄저, 호흡기 탄저, 위장관 탄저, 패혈증, 출혈성 수막염 1994년 경북지역 집단으로 발생 Bacillus cereus : 식중독 Nocardia : 그람양성 간균, 분지된 가늘고 긴 사상형, 약한 항산성,aerial hyphae

Gram pos. bacilli Bacillus anthracis

그람음성세균 Gram negative bacilli Enterobacteriaceae 호기성 또는 통성 혐기성 세균 Nitrate를 nitrite 환원 oxidase 음성 gram neg bacilli 대변에서 검출시 : MacConkey, SS, XLD, EMB E. coli O157 : MacConkey-sorbitol배지 Extended spectrum beta-lactamase (ESBL) E. coli, K. pneumoniae : 병원감염의 주요 원인균 ESBL생성균 확인 Enterobacter, Citrobacter, Serratia : 3세대 cephalosporin을 계속하여 투여 받은 환자에서 내성으로 변하는 경향 Salmonella와 Shigella : 1세대와 2세대 cephalosporin, aminoglycoside 항균제에 의하여 치료가 되지 않기 때문에 감수성으로 보고하지 않는다.

비브리오 및 에로모나스균 Oxidase양성 Vibrio Aeromonas Plesiomonas Pasteurella Comma or curved 극성 편모 V. cholerae, 01, 0139 : 콜레라 대유행과 관련, 국내에는 간헐적으로 있으며 해외에서 유입되어 발생 Non01, nonO139 : 콜레라 독소를 생산하지 않고 유행성 설사와 관련이 없는 설사와 장염 V. mimicus, V. damsela, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus… Aeromonas Plesiomonas Pasteurella Pseudomonas 병원환경에서 흔히 분리 Acinetobacter Haemophilus

V. parahaemolyticus (TCBS) V. cholerae(TCBS) Oxidase test V. parahaemolyticus (TCBS)

Haemophilus 및 HACEK세균 Haemophilus : 상기도의 정상상재균 H. influenzae b : 수막염, 패혈증, 후두개염 X (Hemin)와 V (nicotineamide adenine dinucleotide, NAD)의 증식촉진인자 필요 (균종에 따른 차이 있슴) HACEK bacteria :세균성 심내막염 흔히 유발 H. parainfluenzae, Aggregobacter aphrophilus, Aggregobacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikinella corrodens, Kingella

Gram negative cocci 그람음성 쌍알균 Catalase와 oxidase 양성 Neisseria meningitidis 일반적으로 penicillin에 감수성 Neisseria gonorrhea 검체 채취시 윤활제나 소독제가 섞이지 않게, 솜면봉 채취시 즉시 접종, endo cervix에서 채취 Penicillin에 내성 70%, beta lactamase에 의함 Spectinomycin에 의한 내성은 드물며ceftriaxone에 의한 내성은 보고된바 없다.

혐기성세균 대부분 피부와 점막의 정상균의 무리, 일부 기회 감염균 선행요인: 조직의 손상, 불충분한 혈액공급, 조직괴사, 악성종양, 조직 중에서 산소성 세균의 증식 대부분 내인성 감염 외인성 감염으로는 보툴리누스 중독, C. perfringens 식중독, 가스괴저, 파상풍 검체의 직접검사 악취, 농성 유황과립이 있을때 혐기성 감염을 의심할 수 있다. 임상적으로 중요한 혐기성 세균 무산소성 그람양성 알균 Peptostreptococcus 무산소성그람음성막대균 Bacteroides

배양 원칙 ① 적절한 검체를 채취하여 공기에 노출되지 않게 수송 ② 접종시 검체를 산소에 노출시키지 말며 ③ 새로 만들었거나 환원시킨 배지에 접종 ④ 충분한 혐기성 조건에서 배양 배지 비선택배지 : CDC 혈액배지, brucella 배지 선택배지 : PEBA (phenyl ethyl blood agar), KVLB (kanamycin vancomycin laked blood) 증균배지 : Enriched thioglycollate medium 배양방법 무산소성 단지 (anaerobic jar) 무산소성 상자 (anaerobic chamber)

Anaerobe Jars

Anaerobic chamber 내부는 혐기성 상태, 상자 안에서 검체의 접종, 배양, 분리,동정, 혼합가스 : N2 85%, H2 10%, CO2 5%

Clostridium perfringens 내원당일 새벽 2시경부터 시작된 fever, chill을 주소로 응급실 내원. Gram stain : gram-variable straight rod Double zone hemolysis

Clostridium difficile 정상인의 장내 보균율 : 3%, 입원환자의 장내 보균율 : 30% Antibiotic associated diarrhea, pseudomembranous colitis 신선 설사변 10-20 mL 우리 나라의 경우 B 독소만 양성인 경우가 많으므로 A & B로 해야 배양 : 선택배지 Cycloserin cefoxitin egg yolk fructose agar (CCFA)

미산소성 세균 Microaerophilic bacteria Campylobacter C. jejuni ssp. jejuni 산발성 세균성 장염의 제일 흔한 원인 곡선형, S자형, 긴 나선형의 그람음성간균 Skirrow 등의 선택배지에 접종, O2 5%, CO2 10%, N2 85%, 420C의 환경에서 배양 Helicobacter pylori 위궤양의 원인, 발암의 원인 Urea breath test (C14이 들은 urea용액을 마시고 호기 중의 동위원소 CO2측정) Gastric biopsy (Giemsa염색) O2 5%, CO2 10%, N2 85% 7일간 배양 PCR ELISA 등의 항체시험

만곡된 그람음성간균 양성 음성

나선균 Spirochetes Leptospira Leptospira interrogans 가을철, 동물을 다루거나 논 사탕수수 농장에서 일하는 사람 혈액, 척수액, 요검체 암시야 현미경 : 빠르게 운동하는 나선형 세균 PCR법 조직 : silver stain 배양 : Fletcher 반고체 배지: 30oC, 또는 실온 암소에서 6주간 배양 항체검사 1:100 이상이면 양성

Treponema pallidum 성병매독 쉽게 죽기 때문에 채취한 즉시 시행 Nontreponemal test : Wasserman항체, reagin을 검출 VDRL, RPR Treponemal test :Treponema에 대한 특이항체 검출 FTA-ABS, TPI, TPHA