PCR mediated mutagenesis 생화학 실험 II 담당 조교 : 신진철,장지영

Polymerase Chain Reaction 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능

Polymerase Chain Reaction The three steps of PCR Step 1. Denaturation : double strand DNA 를 열에 의해 single strand 로 분리. Step 2. Annealing : DNA primer가 DNA 에 결합하는 단계. Step 3. Extension : DNA polymerase 에 의해 DNA 합성이 일어나는 단계.

Overlap-extension PCR OE-PCR은 PCR 방법을 이용하여 단백질 분자 내의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 여러 방법 중 하나이다. 단백질 내의 특정 아미노산만을 다른 아미노산으로 변경하기 위해서는 치환 아미노산에 해당되는 DNA 염기서열을 유전자상에서 쉽게 치환할 수 있도록 해야 한다. 치환하고자 하는 DNA 염기서열을 변형시키기 위해서 OE-PCR에서는 4개의 서로 다른 primer들을 사용하여 두 번의 연속적인 PCR을 수행해야 한다 PCR-mediated INSERTION mutagenesis PCR-mediated DELETION mutagenesis Lee, J et al. BioTechniques 36, 398-400 (2004)

Workflow of PCR mediated mutagenesis Primary PCR using chimeric primers C ### ooo A ### ooo D ### ooo B Primary PCR A ### ooo ### ooo D Ligation PCR A ### ooo D

Primer design 시 주의사항 1) 길이는 20~30bp로 제한한다. → 너무 짧으면 결합력이 약하고 너무 길면 시간과 효율면에서 좋지 않음 2) G+C%가 50~60%로 구성되어야 하며 purine과 pyrimidine 염기의 연속적인 배열은 피해야 한다. 3) 한 쌍의 primer가 부분적으로 서로 상보적이지 말아야 한다. → primer-primer dimer의 형성 가능성을 배제하기 위함

Primer design 시 주의사항 4) Primer의 3’말단에 G or C 가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 한다. → 5’말단 sequence는 annealing에 크게 중요한 역할을 하지 않지만 3’말단 sequence는 PCR product가 extension하는 부위이기 때문에 PCR의 sensitivity와 specificity에 중요한 역할을 함. 3개 이상의 G or C는 비특이적인 증폭을 야기하므로 피하는 것이 좋음 5) Primer의 3’말단에 T가 오지 않도록 한다. → Thymine은 올바르지 못한 다른 염기와 misparing할 가능성이 높음 6) Tm값이 동일한 두 primer 설계 (또는 차이가 5℃이하 까지 설계) - Tm value = [4*(G+C) + 2*(A+T)] * annealing temp. = Tm – 3℃ (or 5℃)

Procedure : Primary PCR Ingredient for PCR reaction (Primary PCR) Primary PCR condition Component Quantity per reaction Targets 1-10kb Distilled water 35ul 5x Herculase II reaction buffer 10ul dNTP mix 0.5ul DNA template 1ul Primer A+B : C+D Each 2.5ul/tube Herculase II fusion DNA polymerase Total reaction volume 50ul Temp.(℃) Time 95 2min 30sec 55 72 45sec 5min 30 cycles

Gel electrophoresis result 700bp : primer CD) 600bp : primer AB)

Report 제출기한 : 화요일(10/14) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점 제출기한 : 화요일(10/14) 오후 3시까지 > 늦게 제출 시 태도점수 감점 제출장소 : S401호 (세포주기 연구실) Hand-writing 미 제출 시 0점 처리 인터넷의 자료를 그대로 이용 시 감점처리 기타 문의 사항은 신진철(sking23@naver.com)

Discussion Homework Gel Data 붙이고, 그 결과에 대해 분석할 것. PCR의 세가지 step에 대해 설명할 것. 실험에 쓰이는 Material의 역할과 조성을 조사할 것. primer design할 때 유의사항에 대해 설명할 것. Homework