제 2장 발효와 미생물 1. 유용미생물의 분리와 보존 2. 균주의 개량 - 균주개량의 기본원리 - 돌연변이 - 유전자 재조합 제 2장 발효와 미생물 1. 유용미생물의 분리와 보존  발효공학에 이용되는 미생물들?, 안전한 미생물 ?  미생물의 발굴, 분리, 보존 및 기존 보존균주의 활용법 2. 균주의 개량  생산성 향상과 경제성을 높이기 위한 방법으로 다양한 균주개량 방법이 활용  산업화에 따른 안전성, GMO 등 다양한 측면에서 고려가 필요 - 균주개량의 기본원리 - 돌연변이 - 유전자 재조합 - 재조합 DNA 기술

제 2장 발효와 미생물 - GMO표시제 대상: 식약청이 수입 승인한 모든 GM 농산물로 제 2장 발효와 미생물 - GMO표시제 대상: 식약청이 수입 승인한 모든 GM 농산물로 콩, 옥수수, 유채(카놀라), 면화, 사탕무 등 - GMO 표시대상 농산물을 주요 원재료로 사용하여 제조·가공 후에도 유전자재조합 DNA나 외래단백질이 남아 있는 식품 또한 모두 표시 (단, 3% 이하는 비의도적 혼입치로 인정, 비GMO). * 우리나라와 대만은 3%, 일본은 5%, 호주ㆍ뉴질랜드 1%, 유럽 0.9% 이하 등 - GM 식품 표시 면제 1) 식용유 등: 열처리, 발효, 추출, 여과 등 고도의 정제과정으로 유전자변형 DNA 성분이 남아 있지 않음 예) 식용유, 당류, 간장, 주류 등 2) 식품제조 시 일시적으로 사용되거나 극미량 사용되는 가공보조제나 부형제 등

새로운 미생물, 발효공정, 가공공정, 살균, 유통 등등 유용미생물이란 ? 기존 발효식품의 문제점 점검 새로운 미생물, 발효공정, 가공공정, 살균, 유통 등등 결론: 새로운 미생물의 발굴 어떠한 특징을 갖는 미생물인지 검색 유용미생물을 획득하는 방법 기존미생물? 균주은행, 개인연구자, 연구기관 등 획득 새로이 발굴 해야 하는 지? 발굴과 비교검색

기존 알려진 유용미생물 들

GRAS (Generally Recognized as Safe Substance) FDA_GRAS 등록

2.1 유용미생물의 분리와 보존 2-1-1 유용미생물의 분리 1) 분리의 목적 ① 특정 분류군에 속하는 미생물의 분리  신종, 신속, 신과 신목 등 ② 특정 기질에 출현 또는 분해하는 미생물의 분리  단백질, 지방, 키틴, 유류분해(난분해성물질), 다당류 등 ③ 특정지역 또는 환경에 서식하는 미생물의 분리  고온(80℃~), 저온(10℃이하), 강산, 강알칼리, 고압 등 ④ 특정 생리기능적 기능을 가진 미생물의 분리  항생제, 항암, 항산화, 항바이러스, 특정색소, 자외선차단, 아미노산, 알코올, 유화제, 보습제 등

: 예비조사를 통한 사전기획 - 목적, 문헌조사 등을 통한 충분한 기획 2) 분리방법 시료체취 배 양 순수분리 검색 분리원의 종류 채취장소 체취시기 분리방법 등 시료체취 액체/고체배지 채취환경에 따라 (산소/온도/빛 pH/염도 등) 배양조건고려 배 양 단일균주로 분리 순수분리 목적하는 용도에 따라 활성검색 검색

2-1-1 유용미생물의 보존 1) 보존의 목적 - 보존이란 : 균주를 어떤 연구목적에 이용하기 위하여 생리활성을 유지하면서 필요한 기간 즉 영구보존을 목적으로 한다. 보존시 유의할 점 ① 보존 중에 사멸이나 변이(활성을 유지)를 방지할 것 ② 보존기간을 길게 유지할 것 ③ 오염이 일어나지 않게 할 것 ④ 조작이나 필요한 장치 등이 가능한 한 간단할 것 (편리성/경제성)  보존 중에도 생물의 보존기간에 차이가 있어  정기적(6개월~1년)으로 생존율을 조사

2) 보존방법 (1) 사면배양 보존법 : slant(plate) culture 이용, 생육후 4℃보존, 4주마다 계대, 임시보존 - 단점 : 안정성, 안전성이 낮고, 배지건조시 위험 - 보완 : 유동성 파라핀(mineral oil) 중층법(건조방지, 1년 정도) (2) 동결보존법 : Freezing  -20℃ 이하에서 급 냉동 후 보존 -20℃ 냉동고 -40℃~80℃ 초저온 냉동고 - 1년 이상 보존가능, 재활성화 편리, 유지가 어려움(정전주의) - 동결보호제(cryoprotectant) : 10% Glycerol, 10% DMSO(dimethyl sulfoxide), 10% skim milk 등

(3) 액체질소보존법 - -150℃~196℃ 액체질소 - 균류, 바이러스, 조류, 효모, 동물세포, 식물세포, 조직배양등 광범위 - 수년간 가능, 재활성화 편리 - 유지가 어려운 단점(장치/액체질소 비용이 고가) (4) 건조보존법 - 진공건조 포자생성균에 적합 (5) 토양보존법 - 멸균된 건조토양에 보존, 20년간 보존가능(방선균/균류) (6) 담체보존법 : 실리카겔, 자기비드사용 (방성균/균류)

(7) 동결건조법 - lyophile, Lyophilization, Freeze-vaccum drying - -50℃에서 급냉동후 승화건조, 안정성, 안전성이 높음 - 보존기간 10년이상 상온보존가능, 고가장비필요, 작업이 복잡, 오염가능성 높음, 재생시 장기간 소요 - cf) cryoprotectant(동결보호제)  10% gelatin, 10% skim milk, MSG, lactose, trehalose, mannitol, dextrin(sugar), NaHCO3(젖산균) 등

3) 보존균주관리 (1) 주기적인 생존율 및 역가 (생산성) 확인 (2) 오염주의 (3) 균주대장기록 : ample의 sealing 및 opening : torch lamp, 70% 에탄올, 유리칼, 생리식염수 4) 보존기관 (1) 기탁, 분양기관 : 특허관련 균주기탁, 연구관련 균주분양, 위탁동정, 위탁보존 (2) 기관 - KCTC(Korean Collection for Type Culture, 유전자은행) - KCCM(Korea Culture Center for Microbiology, 한국미생물보존센터) - KACC(Korean Agricultural Culture Collection, 농업미생물은행) - IFO(Institute of fermentation, osaka, Japan) - ATCC(American Type Culture Collection, 미국종균협회) - NRRL(Northern Regional Reasearch Laboratory, USA) - 기타 전세계에 150개의 국가공인가관이 설립

2-2 균주개량 - 배양조건의 최적화  최대생산능력의 한계 - 균주개량  유전형질의 개량 (유전자변형) - 현재 산업적으로 사용되는 개량 균주는  S. cerevisiae, Coryn. glutamicum등에 한정  그다지 많지 않음  유전정보의 제한 2-2-1 균주개량의 기본원리 (1) 미생물의 유전적 특성 - 형질전환, 형질도입, 세포융합, 유전자조작의 기본기술  미생물로 부터 발견 - 고등생물  기관분화에 의존 - 미생물  변화하는 환경에 적응, 기질적응, 광선이나 영양물질에 대한 주성  직접적인 유전자발현 제어계에 대응

□ 산업미생물의 이상적 특징 □ 배양상의 유의성 1) 유전적으로 안정 2) 목적산물을 효과적으로 생산, 생합성경로 규명 3) 비타민과 추가적인 성장인자들을 요구하지 않거나 제한적으로 요구 4) 확보가 용이하고, 가격이 저렴한 탄소원(배지)을 사용 5) 유전자 조작이 용이 6) 안전하며 비병원성, 독성물질을 생산하지 않아야 한다. 7) 발효조에서 회수가 용이 8) 목적하는 생성물이 세포 내에 산물일 경우 세포파괴가 쉬워야 한다. 9) 용이한 정제를 위해 부산물의 생산이 적어야 한다. □ 배양상의 유의성 1) 전통적인 발효기에서 잘 생육 2) 전단력에 민감하지 않거나 3) 과도한 거품이 생산되지 않거나 4) 표면 부착성이 없어야 한다.

(2) 미생물의 유전적 변화

(3) 유전자의 구조 1) 유전자의 본체 - 미셰르(Miescher,1871) 백혈구 핵에서 DNA 발견 - 포일겐(Feulgen,1924) DNA 검출, 핵과 염색체의 주성분  DNA라 증명 - 에이버리(Avery,1944)의 형질전환과 허쉬와 체이스(Hershey & Chase,1952) 형질도입실험  유전자의 본체가 DNA라 증명

2) 유전자의 종류 - 핵유전자(nuclear gene), 염색체유전자(chromosomal gene), - 세포질 유전자(cytogene, plasmid) - 미토콘드리아 유전자(mitochondrial gene), - 색소체 유전자(plastgene)

구조유전자(structural gene  단백질의 1차구조를 결정) 조절유전자(regulatory gene  구조유전자의 작동을 유도/억제하는 것을 조절) 불안전유전자(unstable gene; mutable gene  돌연변이가 쉽게 유발되는 유전자) 돌연변이 유발유전자(mutator gene)  다른 유전자의 돌연변이 율을 증가시키는데 작용

3) 유전자 핵산의 종류 - 유전자의 본체인 핵산의 기본구조

Pyrimidine Purine

DNA의 고차구조 : 2가닥의 Deoxyribonucleotide 사슬이 우조의 이중나선 : Watson & Crick(1953)제안 • 상보적인 염기짝 (A-T, G-C)

• 두 가닥의 역평행 사슬, 각 염기가 나선의 안쪽에서 나선의 중심축과 수직방향으로 짝을 이룸 • 유전자를 복제(자기복제)하여 보존하기 위한 중요한 특징 • 유전정보는 mRNA로 전사되어 단백질의 아미노산 배열로 번역

- 유전자형 : DNA에 포함된 nucleotide 염기서열 - 표현형 : 생물체의 독특한 특징 : 분자적 기초 – 다양한 기능을 나타내는 단백질 ( 구조단백과 기능성단백)  표현형질을 나타내는 중심  DNA  DNA  단백질의 합성을 조절하는 역할 기본적인 단계 1) 전사(transcription) : 유전정보가 DNA 에서 RNA로 전달하는 기전 2) 번역(translation) : RNA의 정보가 단백질로 전달하는 기전 - 유전적 질환 특정효소를 만들 수 없는 것 이러한 질환 – 물질대사의 선천적 결함 (inborn errors of metabolism) - 1 유전자 1 효소설을 주장 - 1 유전자 1 polypeptide

2-2-2 돌연변이(mutation) 돌연변이에 의한 표현형의 변화 - 염기배열의 변화  아미노산 배열  단백질의 기능  구조유전자/제어부위/t-RNA, rRNA…… 변화 ① 단백질의 촉매기능이 변하고 활성을 잃거나, 기질 변화성이 변화 ② Feed back 제어물질 등의 effector에 대한 친화성이 변화 ③ 단백질 고차구조의 변화와 불안정화 등 ④ ① 의 변화 1차대사산물의 변화초래 시  세포의 증식이 억제 - 세포의 증식, 대사, 기능, 색소생성, 형태 등의 형질에 영향을 미침

(2) 돌연변이에 의한 DNA의 변화 - DNA 의 nucleotide 서열의 변화  돌연변이(mutation) - 유전자 내 돌연변이 1) 염기 치환형 (base substitution): Purine간(AG) 또는 Pyrimidine(TC)간의 상호변환 transition : Purine과 Pyrimidine간의 상호변환인 transversion 2) 염기 삽입형 (base insertion) 3) 염기 결실형 (base deletion) - 생명에 미치는 영향은 다양  영향이 없거나, 해롭던가, 향상되는 경향

(3) 돌연변이 유발법 1) 자연돌연변이(spontaneous mutation)  DNA 복제시 일정확률로 일어나는 실수(10-6 ~ 10-8 확률)  염기배열의 변화 초래 2) 변이유발조작(induced mutation)  목적 변이주 개발에 이용  변이원(mutagen)  표 2-2 3) 처리시 세포의 상태고려  NTG : 대수증식세포  자외선 : - 인접 pyrimidine이 결합하여 pyrimidine dimer가 형성 - 회복기구에 의해 회복이 가능 - 실수로 염기치환이 발생 0.1~1%생존율이 되도록 선량을 조사 (가장 효율적 변이 분리가능)

Repair system  에러가 발생시 dimer 부분에 염기치환이 발생

야생형과 변이형을 구분하는 방법  색소함유배지를 써서 colony의 염색성으로 (4) 변이주의 종류와 선택법 야생형과 변이형을 구분하는 방법  색소함유배지를 써서 colony의 염색성으로 식별/대사산물의 분비/효소활성의 유무를 배지를 이용하여 선별 1) 영양요구주 : 1차 대사에 관여하는 효소가 결손 되어, 그 대사산물을 첨가하지 않으면 성장하지 않음 (replica method) : Penicillin 처리에 의해 야생형세포를 선택적으로 사멸 영양요구성세포 선별 (아미노산, 핵산, 비타민, 불포화지방산 등 요구주 분리) 2) 자화능 결손주 : 당 발효능 결손주, 대사산물 분해능 결손주 등 - 효모: 단일 탄소원이나 질소원에서 생육하지 않는 colony를 분리 - 세균: 당 함유배지에서 산을 생성하지 않는 colony를 분리 * 대사과정에서 스스로 어떠한 화합물을 합성할 수 있는 능력이 감소, 결핍된 균주 3) 감수성주 : 온도, 항생물질, 아미노산, 대사유사체, 중금속에 대한 감수성 등 : 소형 colony를 분리하던가 생육도 차이로 분리

4) 내성주 : 아미노산 유사체 내성변이주가 대표, 유사체 존재 시  대사방해로 성장저해, 변이주(내성주)는 유사체에서 도 성장 (핵산, 비타민, 중간대사산물 등) 5) 자화능 증대주 : 특정화합물에 대한 자화능 이나 분해 능이 증대, 야생형 보다 큰 colony 형성 : 효소생성조절이 해제/기질 특이성이 변화 6) 2차 대사산물 합성효소 결손주 : 2차대사산물의 합성은 세포증식에 비 필수적 변이형과 야생형의 증식속도 차이에 의해 선별

2-2-3 세포내 유전자 제조합기술  Recombinant DNA technology; 재조합 DNA기술 - 감수분열, 배우자, 수정의 과정이 없이 증식 - 생식의 형태가 아님 - 유전자재조합기능 - 한 세포에서 다른 세포로 유전자를 전달하는 방식 1. 형질전환, 2. 형질도입, 3. 접합, 4. 세포융합

1. 형질전환 (transformation) - 폐렴쌍구균의 유전자 재조합현상으로 발견(1944, Avery 등)  세포주변으로 부터 DNA를 흡수하는 과정 - Influenza, Neisseria, 고초균 등 G+에서 확인 - 고초균을 이용한 실험(그림 2-4), amylase 생산성 개량 야생형 보다 2000배 분비

2. 접합(conjugation) : pilli를 이용하여 한 세포에서 다른 세포로 유전자가 이동 : 대장균의 F인자  세포질 내에서 plasmid로 복제되는 환상 DNA  염색체에 수용되기도 함 (Hfr) : F-세포에 Hfr 세포를 접촉 F인자의 산물인 sex pili(성 섬모)를 통하여 F-에게 Hfr일부가 이입 이입된 단편이 F- 세포의 염색체와 교차하여 재조합염색체 형성 이때 Hfr 인자가 이탈하고 일부의 염색체 단편을 포함  F prime(2배체)이 효소활성 증대, 약제내성, colicin 생성인자, 방향족화합물분해인자 등의 plasmid가 접합에 의해 전달

3. 형질도입(transduction) : Phage가 한 세포 내로 다른 세균의 유전자를 함께 수용하여 전달하는 기능 : 다른 세포의 유전자가 형질도입하는 데 이용 : 특수형질도입 람다 phage와 같이 숙주염색체의 특정부분을 운반 : 일반형질도입 P1phage 등과 같이 염색체의 어느 부위에서도 동일한 빈도로 운반

4. 세포융합(cell Fusion) : 동물세포에 sendai virus 나 polyethylene glycol을 처리  세포간 융합이 형성 : 세포간 융합을 통하여 잡종세포를 얻음 예) monoclonal 항체를 생산하는 hybridoma 만들어 면역학이나 의학에서 진단시약, 항암제개발에 공헌 : 동물, 식물세포, 효모, 방선균, 곰팡이에서 주로 유용하게 이용 : 2종류의 염색체  2/4배체  분열(염색체 교차/조합)  1/2 배체로 존재

2.2.4 재조합 DNA 기술 (Recombinant DNA technique) - 1973년 Cohn 과 Boyer  Cut and join 만으로 재조합 DNA 만들어 대장균에 형질전환  생물 종의 벽을 넘어 재조합체를 만들 수 있음 - 유전자 조작  생물의 특정유전자를 염색체에서 절단(제한효소)하여 단리(cloning)  이를 생물종에 도입하여 발현, 유전자수를 증가, 유전자의 구조를 임의로 변형 - 응용분야  발효공업, 호르몬, 동식물의 대사산물의 생산을 가능 예) somatostain, insulin, 성장호르몬, secreatin, interferon 등 1) 재조합 DNA 기술의 개요 (1) 유전자재조합의 주요기술 - DNA 분자를 절단하거나 연결하는 기술 - 이종 DNA 단편과 복제능을 가진 vector DNA 단편을 결합하여 잡종 DNA를 만드는 법 - 잡종 DNA를 형질전환에 의해 숙주세포에 이입하여 재조합 세포체를 제작 - 필요한 DNA를 포함한 세포를 검출

(2) 유전자 DNA 제조 - 유전자 DNA 제조법(coning을 하기 위한 첫 단계)  유전자 전달산물인 mRNA 에서 상보적인 염기배열을 가지는 DNA(cDNA)를 역전사효소를 이용하여 합성  DNA 합성기를 이용하여 DNA 화학적인 합성법 등 1) 제한효소 (Restrictiom endonuclease) DNA 염기배열을 인식하여 특정부위에서 DNA를 절단하는 효소군 endonuclease ○ 표기법 (예, Hin d II) Hin : 속명의 시작 1문자, 종명의 2문자 = 3문자로 구성 (이텔릭자) d : 주명 및 plasmid 유래 1문자 II : 복수효소가 있을 시 아라비아 숫자를 붙임(성질에 따라 I, II, III) ○ 발현시  Mg를 요구하나, ATP 등은 요구하지 않음 ○ 인식절단부위  2~6 염기쌍, 2회전 대칭배열 ○ 5’  인산기, 3’  OH기가 붙은 구조 ○ 재연결시  ligase 작용 ○ 제한효소에 의한 말단부근의 구조 : 평활단면(2가닥의 DNA를 양쪽의 동일한 부위에 절단 : 돌출형(절단위치가 서로 달라 돌출되는 형 5’ 또는 3’ 말단) Page 43 2) DNA의 연결, 합성, 인산화 등에 관여하는 효소 : DNA ligase, DNA polymerase, polynucleotide kinase, 역전사효소, 인산화효소등

DNA를 자르고 붙이는 효소 : 한 DNA 분자에서 유전자를 추출하여 다른 분자로 삽입 – 정확히 “자르고” “붙이” 는 과정이 필수 : 자르는 수단 (단백질 ) - 제한 효소(restriction enzyme) ; 외부로부터 침입한 생명체나 phag로 부터 자신을 보호하기위해 DNA를 잘라버리는 기능 : 붙이는 수단(단백질) - DNA ligase ; 주변염기사이에 공유결합을 도와주어 DNA 가 연속적으로 결합하는 기능

(3) Vector DNA 제조 - Cloning Vector : 특정의 세포에서 복제, 증식을 할 수 있는 외래 DNA의 운반체 : 복제 능력이 없는 외래 DNA 단편과 결합하여 숙주세포 내에서 복제됨 - Vector 의 유래 : plasmid, Bacteriophage(virus), plasmid와 phage의 중간체 cosmid : 동물세포와 형질전환에 쓰이는 sv-40 virus : 식물세포에 이용되는 Ti plasmid 등 - 특정세포와의 관계에서 유효하다 (숙주-vector계) : 대장균-Vector, Bac. subtilis, Streptomyces, Sac. cerevisiae : 두 종의 세포에서 복제되는 shuttle-vector

- Plasmid를 cloning vector로 사용할 경우 고려  분자량이 적고, plasmid DNA의 검출이나 분리, 정제가 용이  제한효소에 의한 절단부위가 있고 이종의 DNA를 삽입하여도 복제능을 잃지 않아야 한다.  재조합형 plasmid DNA를 세포에 삽입하여도, plasmid 보유균을 선택할 수 있는 유전 marker가 있을 것 대표적인 예 표 2,4

(4) 재조합 DNA 제조 1) 제한효소에 의해 만들어진 부착말단의 연결법 : Plasmid vector와 외부 DNA를 Eco RI 와 같은 제한효소처리  부착말단을 만든 후  ligase 로 부착  DNA 농도가 높을 때 주로 사용

2) Alkaline phosphatase를 이용한 평활 말단연결법 - DNA 농도가 낮으면  plasmid vector가 ligase에 의해 plasmid dimer를 만들 가능성이 높다  효소로 인산을 제거하여 –OH 만 남게 한 후  외래성 DNA를 넣어 ligase 처리  성공확률을 높일 수 있음

3) linker molecule 부착법  제한효소 절단부위가 없는 유전자의 부착 (연결분자를 삽입)  평활 말단의 외래 DNA 의 말단에 Eco RI target site를 함유한 linker molecule  T4 DNA ligase 로 부착  Eco RI로 잘라 부착말단을 만들어 vector 에 연결

4) Homopolymer tailing 법  단일폴리머를 부착하여 연결분자로 이용  endonuclease로 DNA 말단부분을 자른 후  terminal transferase로 한쪽 DNA 가닥에는 dATP로 adenine을 붙이고  다른 한 쪽 끝에는 dTTP로 thymidine을 붙여 2개를 섞어 anneal을 하면  homopolymer에 의한 TA결합으로 외래성 DNA를 붙일 수 있다,

5) cDNA를 이용한 Homopolymer tailing 법 : 외래성 DNA가 cDNA 인경우의 재조합 DNA 조제법  mRNA를 terminal transferase을 사용하여 adenine 을 붙이고  oligo(dT)를 adenine에 붙여 역전사효소를 사용하여 cDNA 를 만든다.  S1 nuclease 로 cDNA 의 hairpin loop 를 잘라  terminal transferase을 사용하여 adenine 을 붙이고  plasmid를 Pst I으로 자른 후 annealing 을 시키면 숙주가 gap을 수리

(5) 재조합 DNA 분자의 숙주세포 내로의 주입  세포의 특성에 따라 차이  CaCl2를 처리하는 방법이 널리 이용  Protoplast를 만들어 polyethylene glycol 로 처리하여 DNA를 주입 : 고초균, 방선균, 효모에 널리 이용 (6) 재조합 DNA 함유 세포의 검출법  재조합 DNA를 세포 내에 주입시킨 후 잡종 DNA 를 선택  전환체를 선택하기 위한 marker (예, 약제내성) 1) maker rescue 법 (약제내성을 통한 확인) 2) 상보성 시험 3) 발현유전자 산물 동정 (면역, 단백질활성) 4) 잡종세포법 등

(7) Clone 화된 유전자 산물의 증강  Clone 화된 유전자의 효율을 증강은 무엇보다 중요  Clone 화된 유전자의 발현효율에 영향을 미치는 요인은 다음과 같으며 적절히 조절할 필요 ① 유전자량(gene dosage) : vector의 복제 수, 안정성 등 ② 전사효율 : promoter, terminator 의 구조와 관련 ③ 번역효율 : shine-Dalgarno 배열, SD 배열과 개시 codon과의 거리, codon 사용빈도, mRNA 안정성 등 ④ 생산물의 안전성 : 숙주 protease 등의 영향

(8) 유전자 구조의 개변  재조합 DNA기술 : 임의의 부위에 적당한 종류의 변이를 도입  유전자상의 특정부위에 돌연변이를 도입하는 방법  유전자 개변에 의한 단백질 및 기능의 개량 가능성이 높다  효소의 활성중심, 효소의 특이성을 임의적으로 변화하는 데 이용  단백질의 구조와 기능과의 관계가 해명 : 인공효소도 생산할 수 있음