RT-PCR법을 이용한 결핵 검출법 (SLAN장비의 소개) 2009. 6. 4. 미생물파트 조인주

결핵균의 특징 막대모양의 간균 다른 균에 비해 증식정도가 느림 세포벽이 있어 산/알카리에 강함 열과 빛에 약함 호기성

결핵 발생 현황(2006년) 88.0명 (2007) 10.0명 1.5명 (2007) Reference 를 기록하시면 좋을 듯 합니다. 13.1명

국가 결핵관리의 목적 선진국은 물론 개발도상국보다도 높은 유병률을 보이고 있는 만성 국가결핵관리 보건기관 민간의료기관 국가 결핵관리의 목적 선진국은 물론 개발도상국보다도 높은 유병률을 보이고 있는 만성 전염병 질환인 결핵을 조기 퇴치하여 국민 보건향상에 기여함 자료:2007 결핵관리지침 예방사업 환자발견사업 등록치료사업 BCG접종 예방화학치료 엑스선 검사 객담 검사 환자관리 투약치료 조기진단 조기발견 예방사업확대 발병예방 개인건강증진 전염원 제거 국민보건향상 결핵의 조기퇴치 국민건강증진

본원의TB PCR 검출법 MTB ID (Seegene): 결핵균과 비결핵균의 감별 MYCO ID (M&D): 비결핵균의 동정 MTB PCR 2002년부터 Roche사의 Cobas amplicor사용 민감도가 낮고 재현성이 떨어짐 RT-PCR을 이용한 검사장비가 개발됨 2008년 11월부터 SLAN장비 사용 제목 : 본원에서 시행하는 결핵 검출법

Real Time PCR 원리 PCR 증폭 산물을 실시간으로 모니터링 하여 해석하는 기술 목적 DNA polymerase와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량 Threshold cycle (CT) PCR 증폭산물에 의한 형광 양이 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 초기 타겟 양을 비교적 정확하게 반영함.

Real time PCR – Taqman Probe 1) 5’ 말단은 reporter 형광 dye, 3’ 말단은 quencher 형광 dye로 수식한 oligonucleotide를 이용 2) Annealing step에서 주형 DNA 에 특이적으로 결합하나, Probe 상의 Quencher에 의해 형광 발색 억제(FRET 현상) 3) Extension step에서 Taq pol (5’->3’ exonuclease)에 의해 형광 발현

SLAN real time PCR system Reagents Pre-treatment solution 1 Pre-treatment Solution 2 DNA Extraction Buffer 2X PCR mixture TB/NTM primer/probe mixture TB/NTM Positive Control TB/NTM Negative Control 8

SLAN real time PCR system 9

특 성 다양한 형태의 검체에 적용 간편한 실험 과정 일반 PCR tube 사용가능 특 성 다양한 형태의 검체에 적용 간편한 실험 과정 일반 PCR tube 사용가능 다수의 검체 동시 검사 가능 (48 well) 빠른 결과 : PCR 반응 시간 75분 PCR 산물에 의한 반응 오염 방지 TB/NTM 을 특이적으로 검출 높은 민감도와 특이도 다수의 검체 동시 검사 가능 (48 well) : 첨가하심이 어떤지,,

검 사 과 정 75분 소요 전처리 NaOH법 적용 DNA 추출 간편한 Boiling Method 적용 PCR혼합액 제조 DNA 5㎕과 primer 5㎕ 첨가 분석 Taqman probe 사용 75분 소요

결 과 판 독 기준 양성 판정 기준 CT 값 TB 35 cycles NTM Internal Control

결 과 해 석 MTB complex NTM Interpretation 1 No CT negative 2 CT값 < 35 TB complex infection 3 NTM infection 4 “NTM CT값 – TB CT값” ≤ 0 TB & NTM co-infection 0 < “NTM CT값 – TB CT값” TB Complex

결 과 해 석 1 TB complex NTM Interpretation 1 No CT negative 2 CT값 < 35 TB complex infection 3 NTM infection 1. Negative 2. TB complex infection 3. NTM infection

결 과 해 석 2 TB complex NTM Interpretation 4 CT값 < 35 “NTM CT값 – TB CT값” ≤ 0 TB & NTM co-infection 0 < “NTM CT값 – TB CT값” TB Complex infection 4-1. TB & NTM infection 4-2. TB complex infection TB complex - IS6110을 특이적으로 증폭 NTM & TB complex - rpoB 유전자를 특이적으로 증폭

Real-time PCR 결과 비교 (SLAN vs Cobas Taqman)

방 법 기간: 2008년 10월 건수: 132건 대상 Cobas Amplicor Cobas Taqman SLAN 검체 방 법 기간: 2008년 10월 건수: 132건 대상 Cobas Amplicor Cobas Taqman SLAN 검체 Sputum: 87건 Body fluid: 34건 그 외: 11건

결 과 TB NTM No growth/ negative Total 배양 9 (6.8) 1 (0.8) 122 (92.4) 결 과 건수(%) TB NTM No growth/ negative Total 배양 9 (6.8) 1 (0.8) 122 (92.4) 132(100) Cobas Amplicor 6 (4.5) NA 126 (95.4) Taqman 14 (10.7) 118 (89.3) SLAN 10 (7.6) 121 (91.6) * NA : Not Available

결 과 해 석 Cobas Taqman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 SLAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 배 양 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cobas Amplicor 1 2 3 4 5 6 AFB Smear + - SLAN : 25.6 Cobas Taqman : 32.4 CT값 10 20 30 40 50 SLAN : 25.7 Cobas Taqman : 43.0 19

검사건수 및 검사비 07’ 08’ 09’

결 론 Real-time PCR을 이용함으로, 검사과정의 단순화 및 검사시간의 단축 결 론 Real-time PCR을 이용함으로, 검사과정의 단순화 및 검사시간의 단축 결핵균 검출의 민감도와 특이도 향상으로 환자에게 정확한 검사결과를 제공 기존의 방법과 비교하여 재료비의 절감과 검사건수의 급격한 상승으로 순이익의 증가