Stimuli-sensitive system in endogenous Centrally, hypoixa-sensitive system on cancer Department of biomaterials science, Pusan National university Supervisor: prof. Beum-soo An Presenter: Jea Sic Jeong 1

On-demand drug delivery 1. Definition of On-demand drug delivery Be capable of on-demand release of therapeutics promise a substantial improvement in the treatment of many local diseases. Finer control over drug concertration at disease sites Peripheral, off-target side effects can potentially be avoided 2. Kinds of On-demand drug delivery Ultrasound-triggered drug delivery Magnetic-stimulated drug delivery Electric-stimulated drug delivery Light-triggered drug delivery Chemically-tiggered drug delivery Nucleic stimulated release Small molecule triggered drug relesase 앞선 발표자가 on demand drugdelivery에 대해 설명을 하였지만 다시 간단하게 설명드리겠습니다. 현대사회의 drug delivery 에서 각광 받고있는 방법이 약물 방출에 있어서 on-demand 하게 컨트롤 할수 있는 방법입니다. 그 방법으로는 대표적으로 다음과같이 있고, 피지컬 자극에의한 4개, 약리적 자극에의한 반응 3개 장점으로 첫번째는 경구나 정맥투여에 비하여 상처 부위나 질병 노출 부위에 약물의 농도를 보다 잘 컨트롤 할수있고 두번째는, 약물이 부위에 특이적으로 나타나기때문에 부작용이 낮다. 이렇듯 on demand drug delivery는 외부 자극에 의하여 약물이 전달되는 것을 말하며 이는 외인 자극 반응성과 내인 자극 반응성으로 나눌수 있습니다.

Exogenous stimuli-responsive drug delivery 1. Kinds of Exogenous stimuli-responsive drug delivery Thermoresponsive systems Magnetically responsive systems Ultrasound-triggered drug delivery Light-triggered drug delivery Electroresponsive systems 앞선 발표자가 발표한 내용이 바로 외인 자극반응성이고 간략하게 보자면 다음과 같은 시스템이 있습니다. Page  3

Endogenous stimuli-responsive drug delivery 1. Kinds of Endogenous stimuli-responsive drug delivery PH-sensitive systems Enzyme-sensitive systems Redox-sensitive systems 간단하게 PH sensitive system과 enzyme-sensitive system을 보고 redox sensitive system에 대해서 좀 자세하게 보겠습니다. Page  4

Endogenous stimuli-responsive drug delivery 2. PH-sensitive systems The use of polymer  comformation, solubility changes in response to envirmnetal PH variation The use of Polymeric systems with acid-sensitive bond  Release of molecules anchored at the polymer in response to envirmnetal PH variation 대표적인 엔도제너스한 자극반응성 드러그 딜리버리 3개중에서 PH system에 대해 간단히 보겠습니다. PH시스템에서는 크게 두가지의 전략을 사용하며 첫번째로는 특정 폴리머를 사용하여 PH의 베리에이션에 의해서 형태가 변형되거나 용해도의 변형을 이용하여 약물을 전달합니다. 그리고 두번째는 acid에 sensitive 한 bond를 이용하여 ph베리에이션에 의해서 폴리머에 부착되있는 물질이 방출되는 원리로 약물을 전달할수있습니다. A 그림은 Phis(polyhistidine-base) 미셀인데 이는 산성환경이 아닐때 즉, 수소이온의 농도가 낮을때는 그냥 위와같은 형태로 있다가 수소이온의 농도가 높아지면 이온화된 폴리 히스티딘 부분이 생기면서 TAT(trans-activating transcriptional activator) sequence가 외부로 노출 되면서 원하는 transcrition이 일어나게 되면서 반응이 일어난다. *PEG(polyethylene Glycol) 세포융합에 주로 사용되는 것. 솜 모양으로 되어있고 안에 원형질체가 있다. 주로 암세포와 정상세포를 융합할때 사용한다. *TAT(trans-activating transcriptional activator) sequence : 사람면역결핍바이러스(HIV) 유전자의 하나. 바이러스유전s체의 전사와 전사 후 양쪽에 작용한다. tax유전자와 마찬가지로 HIV의 LTR의 U3부위에 있는 NFκB/SP1부위에 작용하여 전사를 촉진한다. LTR의 R영역이 처음부터 전사가 시작하는데 1번부터 57번 염기까지의 RNA는 머리핀구조(stem-loop)를 형성한다. 이 부위를 TAR배열이라고 하며 전사된 후부터 작용하므로 RNA증폭자이고, Tat는 TAR에 특이적으로 결합하여 좀더 하류의 전사를 촉진하는 단백질이다. TAR의 존재 유무에 관계하지 않고, Tat단백질은 핵소체에 집적된다. 단점:ㅣ Page  5

Endogenous stimuli-responsive drug delivery 3. Enzyme-sensitive systems Enzyme-mediated drug delivery exploited the presence of enzymes in the extracellular enviroment Recently, using of short peptide sequence, cleavable by matrix metalloproteinase Precise information of the target enzyme levels at the desired site is needed to fine-control cell uptake 다음은 enzyme sensitve system입니다 특정 엑스트라 셀룰러 환경에서의 엔자임으로 인하여 약물이 전달되는 것을 말하며 최근에는 그림a와 같이 짧은 팹타이드 시퀀스를 이용하여 세포안에 직접 penetration되도록 하여 약물을 전달합니다. 그림a는 리포좀 속에 약물이 있고 TAT가 연결되어 있으며 mAB 2C5와 peptide가 있습니다. Mmp2를 만나면 cleavage가 일어나며 TAT sequence가 노출되고 이는 세포속으로 흡수되도록 도우면서 안으로 흡수되어서 약물이 방출될수 있는 메커니즘입니다. 그림b는 lipase에 sensitive하게 약물을 방출하여 항균 효과를 나타내는 메커니즘입니다. 이러한 enzyme sensitve sysytem은 해당 싸이트에 특정 엔자임을 찾는 것이 중요하기때문에 좀더 정확할수도 있지만 엔자임을 찾기가 어려울수 있는 문제점이 있습니다. Page  6

Endogenous stimuli-responsive drug delivery 4. Redox-sensitive systems An oxidation-reduction (redox) reaction is a type of chemical reaction that involves a transfer of electrons between two species.

Redox-sensitive system 1. Hypoixa A condition in which the body or a region of the body is deprived of adequate oxygen supply at the tissue level 먼저 redox sensitve system에 대하여 설명하기 위해서는 hypoxia의 이해가 먼저 필요합니다. Hypoxia는 말 그대로 산소부족 증상입니다. 사람 몸전체에서의 하이 폭시아는 호흡계의 이상으로 산소부족이 생기고 이로인해 몸의 변화를 말합니다. 국소적으로 보면 조직이나 세포에 국한하여서도 hypoxia가 일어날수 있습니다. ㅎ Page  8

Redox-sensitive system 2. Hypoixa-cancer localised tumour outgrows its vascular supply tumour hypoxia arises in regions with impaired oxygen delivery 저는 하이폭시아를 세포의 국소적 측면에서 더나아가 암조직 및 암세포의 측면에서 조사를 해보았습니다. 위 그림을 보시면 정상세포사이에 암세포가 자라나고 있습니다. 암 조직이 거질수록 혈관생성이 되지만 모든부분에 생기는게 아니기 때문에 암의 중앙부분에서 멀어질수록 하이폭시아 환경이 만들어 집니다. 기본적으로 하이폭시아 상태가되면 산소에 디펜던트한 메커니즘이 일어나지 않습니다. 여기 그림을 보시면 세포에서의 glycolysis 과정인데 미토콘드리안에서 일어나는 TCA회로 를 비롯하여 OXPHOS는 산소에 디펜던트 하기때문에 일어나지 않습니다. 그러나 암세포에서 하이폭시아 환경이 생기면 그에따라 HIF1 이라는 hypoxia inducible factor이 나와서 또 다른 메커니즘을 거치게 됩니다. Hif1이 이러한 여러가지 엔자임을 생성하게 하여서 TCA 회로가 아닌 메커니즘을 통하여 ATP즉 에너지를 생성하고 pyruvate에서 젖산까지 생성을 합니다. 암세포도 세포이기때문에 에너지가 필요한데 산소가 부족한 환경에서도 끊임없이 전이및 성장한다는 것에대한 증거가 될수있습니다. 이렇게 암조직에서는 hypoxia환경이 생겨날수 밖에 없는 구조입니다. 이러한 hypoxia를 sensitive하게 target 할수잇는지 자세하게 알아보겠습니다. Page  9

Redox-sensitive system in cancer 3. The mechanism of hypoxia-sensitive systems 1 A hypoxia-activated phototrigger for highly discriminating photorelease of anticancer drug Nitroimidazole Coumarin PET(photoinduced electron transfer) 먼저 조사한 방법은 빛을 이용하였을때 하이폭시아 환경에서 발광이 일어나면서 약물이 방출되는 시스템입니다. 사용되는 물질은 그림을 보시면 니트로 이미다졸이있고 코우마린이 있습니다. 평소 산소 양이 충분한 환경에서는 빛을 받은 코우마린의 전자가 pet에 의해서 니트로이미다졸로 가기 때문에 형광현상이 일어나지도 않고 cleavage도 일어나지않습니다. 그러나 하이폭시아의 환경에서는 o2가 없는 환경이므로 니트로이미다졸의 엔오투 부분이 아민기로 환원되면서 반응이 일어나기 시작합니다. Pet가 없는 하이폭시아 환경에서 빛을 받아 전자가 발생하면 빛을 발광하며 동시에 cleavage가 일어나서 약물을 방출합니다. 이로서 암세포가 이미징되면서 약물에의해 사멸할수있습니다. Page  10

Redox-sensitive system in cancer 3. The mechanism of hypoxia-sensitive systems 1 The fluorescence intensity of coumarin is strongly dependent on the oxygen concentration Living cells incubated with TAP under normal condition did not display any cyto- toxicity either with light illumination or in the dark 다음 실험결과는 HeLa cell (자궁경부암 세포)를 가지고 산소의 농도에따라 발광이 얼마 나 되는지를 확인한 결과로서 coumarin이 산소농도에 따라 발광 정도가 확연히 다르다는 것을 알수 있습니다. 그리고 이 그래프는 HeLa cell (자궁경부암 세포)을 이용하여 MTT assay를 통해 cell의 viability 를 확인 하였습니다. Positive contrlol인 etoposide 왼쪽 그래프는 mcf-7 cell 로 (유방암 세포)이고 이역시 cell의 viability 를 확인 하였습니다 아직 in vitro에 국한되있다. Etoposide:  DNA회전효소(DNA isomerase)Ⅱ 저해활성을 하며, 세포분열을 중기에서 정지시켜 세포중식을 억제하는 작용

Redox-sensitive system in cancer 4. The mechanism of hypoxia-sensitive systems 2 Hypoxia-responsive polymeric nanoparticles for tumor-targeted drug delivery Nitroimidazole Carboxymethyl dextran Doxorubicin (DOX) 다음으로 조사한 방법은 하이폭시아 환경에 반응하는 폴리머를 이용한 방법입니다. 앞의 방법과 비슷하게 니트로 이미다졸이 사용하며 백본으로 칼복시메틸 덱스타란이 사용됩니다. 이 두개로 독소루비신을 담지하여 나노 파티클을 만들어서 사용합니다. 이 나노 파티클은 하이폭시아 환경의 암세포를 찾아 EPR효과(enhanced permeation and retention)로 세포 안으로 들어가게 되며 약물을 방출합니다. EPR효과 : The enhanced permeability and retention (EPR) effect is the property by which molecules of certain sizes (typically liposomes, nanoparticles, and macromolecular drugs) tend to accumulate in tumor tissue much more than they do in normal tissues

Redox-sensitive system in cancer 4. The mechanism of hypoxia-sensitive systems 2 The release rate of DOX from HR-NPs was significantly higher in hypoxic conditions than in normoxic conditions It is evident that the hypoxia-responsive DOX-HR-NPs prepared in this study have the capability for effective delivery of hydrophobic drugs into hypoxic cells 오른쪽 그래프는 drug인 DOX를 담지한 나노 파티클이 하이폭시아 상태와 그렇지 않은 상태에서의 dox의 방출량을 비교한것인데 하이폭시아 환경에서 더 많이 방출된것을 알수있습니다. 그리고 cell viability를 확인 하기위해 scc7 cells(편평상피암세포) 을 MTT assay를 통해 확인 한 결과 하이폭시아 환경에서의 나노파티클을 treat한 경우가 노목시아 환경보다 유의성있게 cell viability가 줄어든것을 확인할수있습니다.

Redox-sensitive system in cancer 4. The mechanism of hypoxia-sensitive systems 2 HR-NPs can effectively reach the hypoxic tumor site after systemic administration in vivo minimal increase in the tumor volume was found for the group treated with DOX-HR-NPs, suggesting the high anti-tumor efficacy 다음은 in vivo 실험입니다. 누드마우스에 scc7(편평상피암)을 유발시키고 정맥주사로 라벨링 된 나노파티클을 주입한뒤 시간에따라 이미지를 확인한 결과 혈액내에 12시간까지는 잔류되있는것을 확인하고 그후 해부를 하여 각 기관별로의 발광 정도를 비교한 결과 암 조직에서 많은것을 확인할수있었습니다. 그리고 나노파티클의 효험을 보기위해 saline과 free DOX와 나노파티클을 주입하고 암 조직의 크기를 비교하였습니다. 그결과 하이폭시아 환경에서 dox가 방출되는 나노파티클의 효과가 가장 큰것을 볼수 있었습니다. Page  14

Conclusion ss

Thank you