Chap. 6. How Cells Grow

Introduction ▶ Cell growth : 물리화학적 환경에 대한 가장 기본적인 반응 ▶ 복제(replication)와 세포크기의 변화(change in cell size). ▶ 영양소(substrates)을 이용하여 시간에 따라 세포질량(cell mass)이 증가 substrates + cells → extracellular products + more cells ( ∑S + X → ∑P + nX) ▶ Definition of Specific Growth Rate(비성장속도) m : Specific growth rate (h-1) X : cell mass concentration (g/L) t : time (h) m ≡ 1 X dX dt ≡ m X or ▶ 비성장속도에 영향을 미치는 환경요인 - 온도, pH, 산소 - 영양소, 생산물, 독성물질

배양(Cultivation)의 종류 ▶ 회분식 배양 (Batch culture) : 초기에 한번 배지를 채운 후 더 이상의 영양 물질의 공급이나 제거 없이 세포를 배양하는 방법 ▶ 유가식 배양 (Fed-batch culture) : 영양물질은 연속적으로 또는 반연속적으로 공급, 세포 및 생산물을 포함하는 배양액은 불연속적으로 제거 또는 배양 종료시까지 제거하지 않고 배양하는 방법 ▶ 연속식 배양 (Continuous culture) : 새로운 영양배지가 계속 공급되며 동시에 세포 및 생산물을 포함하는 배양액을 공급속도와 동일하게 제거하면서 배양하는 방법

Determining Cell Concentration 1. Cell number concentration 1) Hemocytometer (Petroff-Hausser slide) 2) Viable cell count (petri dish) <Colony Forming Unit (CFU)> 3) Electronic particle counter Fig. 6.1 ○ 세포가 갖는 높은 전기저항에 기초 ○ 세포를 포함하는 전해용액이 오리피스(orifice)를 통과할 때 저항이 발생 ○ 이 저항을 맥동 현상 (pulse)로 변환하여 세포 수를 계산 또는 세포크기의 분포 측정 ○ 일정한 부피에 존재하는 미생물의 수를 현미경으로 측정 ○ 총균수를 측정하는 방법 ○ 투명한 배지, 측정을 방해하는 입자의 제거

2. Cell mass concentration 1) Direct methods - Dry cell weight (filtration or centrifugation), 가장 보편적 방법 - Packed cell volume (centrifugation), 대략적 추산 방법 - Optical density (light scattering, 600-700nm), 가장 간편한 방법 OD Dry cell weight 2) Indirect methods : measure biomolecule concentration and correlate to dry cell mass concentration (DNA, protein, ATP, NADH, product formation) NOTE; high concentration of cells- wrong OD600

Growth of bacterial population Exponential growth Geometric progression of the number 2. 21-22 1 and 2 number of generation that has taken place Arithmetic scale - slope Logaritmic scale - straight line Assume bacteria growing gen time 20 min. Tabellen; 0 min – 1 bacteria 20 min 2 bacteria 40 min 4 bacteria And so on. The increase in an exp grow bact cult is a geometric progression of the number 2. As two cells double 2-4 21-22 1 and 2 number of generation that has taken place Arithemitic ; Number of bacterial cells arithmetic Time incubation growth High cell numbers, log scale better. Straight line-exponentila growth characteristics. Characteristics of exponential growing cells; Slow and the very fast arithmetic scale

Growth of bacterial population Batch growth refers to culturing cells in a vessel with an initial charge of medium that is not altered by further nutrient additional or removal. EACH PHASE The scale is log10, number 6; 106 bacteria (viable organisms)

LAG-PHASE (지연기) No increase in cell numbers Induction of enzymes to utilize substrate(s) Lag phase occurs directly after inoculation Brief or extended Depend on the history of the culture to be inoculated and growth condition Very important to decrease lag period to improve productivity There is an initial lag phase History of the culture to use as inoculum Growth medium Inoculum; Exp phase culture inoculted into rich media, brief lagphas Inoculum; Exp phase cultures from rich media into poorer media, metabolic change, enzymes might have to be down up regulated, change in gene expression and so on- longer lag phase. Inoculum; cultures grown over night, stationary phase, depleted of various essential nutrients changed metabolic status and gene expression. Into rich medium, long lagphase since it takes time to synthesis new enzymes. Although there is no apparent cell division occurring, the cells may be growing in volume or mass, synthesizing enzymes, proteins, RNA, etc., and increasing in metabolic activity. size of the inoculum; time necessary to recover from physiacal damage or shock in the transfer; time required for synthesis of essential coenzymes or division factors; and time required for synthesis of new (inducible) enzymes that are necessary to metabolize the substrates present in the medium.

EXPONENTIAL-PHASE(대수/ 지수 생장기) Scientific research Nutrients and substrate concentration are large Maximum growth where cell number increases exponentially. Balanced growth wherein all the cells are dividing regularly by binary fission → Cell composition are constant

Exponential phase (Balanced growth)

Deceleration phase

Stationary phase m = 0

Death phase K’d : first-order death-rate constant X

Stoichiometric Coefficients for Growth Yield coefficients, Y, are defined based on the amount of consumption of another material. 생장수율 Because ΔS changes with growth condition, YX/S is not a constant

Microbial Products 1. Growth associated products : products appear simultaneoulsy with cells in culture 2. Non-growth associated products : products appear during stationary phase of batch growth 3. Mixed-growth associated products : products appear during slow growth and stationary phase

예제 6.1 시 간 (h) 세포농도 (g/L) 포도당 농도 1.25 100 9 2.45 97 16 5.1 90.4 23 10.5 76.9 30 22 48.1 34 33 20.6 36 37.5 9.38 40 41 0.63 ○ mmax = ? ○ Yx/s = ? ○ if initial glucose conc. 150g/L with the same inocolum size, Xmax = ?

환경조건이 세포생장에 미치는 영향 (How Environmental Conditions Affect Growth Kinetics) ■ 온도의 영향 ○ 생장온도에 따른 분류 - 저온성 미생물 (psychrophiles: Topt< 20 oC) - 중온성 미생물 (mesophiles: Topt= 20 ~ 50 oC) - 호열성 미생물 (thermophiles; Topt> 50 oC) ○ 최적 생장 온도를 향해 온도가 상승할 경우, 생장속도는 매 10℃ 마다 2배 증가 ○ 최적 생장 온도 보다 높은 범위에서는 생장속도가 감소하며 사멸현상 발생

환경조건이 세포생장에 미치는 영향 ■ 온도의 영향 (How Environmental Conditions Affect Growth Kinetics) ■ 온도의 영향 사멸이 생장보다 온도에 더 민감하다

환경조건이 세포생장에 미치는 영향 (How Environmental Conditions Affect Growth Kinetics) ■ 온도의 영향 ○ 최적 생장 온도를 향해 온도가 상승할 경우, 생장속도는 매 10℃ 마다 2배 증가 ○ 최적 생장 온도 보다 높은 범위에서는 생장속도가 감소하며 사멸현상 발생

■ pH의 영향 ○ pH는 효소의 활성에 영향을 미침으로서 세포의 생장속도에 영향 ○ 생장의 최적 pH와 product의 생산을 위한 최적 pH는 다를 수 있다. ○ pH가 최적값과 다를 때는 현상유지를 위해 에너지 필요량이 증가 ○ 배양액의 pH 변화 - pH 상승 : 질소원의 형태 - pH 하강 : 탄소원의 이용에 따른 유기산의 생성등 ○ 일반적으로 배양액의 pH 변화를 모니토링하여 pH 조절

■ 용존산소의 영향 ○ 임계산소 농도 이상에서는 생장속도가 용존산소 농도와 무관 ○ 임계산소 농도 이하에서는 산소가 생장 제한 인자 ○ 용존산소의 양은 용액의 녹아있는 물질의 종류 및 농도에 영향을 받음 ○ 용존산소의 양은 용액의 온도나 기압에 영향을 받음 ○ 용존산소 제한을 극복하기 위하여 - oxygen-enriched air 사용 - 높은 압력 (2~3atm)하에서 운전 - agitation speed 변화

■ 미생물 생장에 따르는 열 발생 ○ 호기성 대사의 경우, 기질 에너지의 약 40~50%는 생체에너지로 변환 ○ 나머지는 열로써 방출 → 발효열 ○ 발효열은 배양계의 적정한 온도유지를 위하여 제거 - 냉각 자켓 - 냉각 코일 - condensation