Development & Cell Differentiation Laboratory 생화학 실험 (1) 10주차 효소반응속도론 Development & Cell Differentiation Laboratory 담당조교 : 신윤철(통합7학기), 신윤호(통합5학기)

Development & Cell Differentiation Lab. Enzyme & Enzyme kinetics Catalytic power 대부분 proteins E + S → ES complex → E + P Activation energy (Ea or ΔG‡)를 낮춤으로써 반응속도를 증가시킴. Activity는 온도, chemical environment (pH), substrate의 농도에 의해 영향을 받음. Very specific (substrate specificity) lock & key model, induced fit model Holoenzyme : apoenzyme (protein) + cofactor (coenzyme) Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Enzyme & Enzyme kinetics 효소 촉매에 의해 일어나는 화학반응을 연구하는 학문 효소반응 속도에 영향을 미치는 요인 Enzyme의 농도, substrate의 농도, inhibitor의 농도 반응속도(v) A → P V = -ΔA/ ΔT = ΔP/ ΔT V = k[A] (k = rate constant) A + B → P V = k[A][B] Enzymes의 kinetic property 농도를 측정할 수 있는 거라면, Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Enzyme kinetics (효소반응에 영향을 미치는 요인) 효소의 농도에 따른 효소반응속도 효소의 농도가 증가할수록 반응속도(V) 증가 효소농도의 변화는 항상 반응속도에 영향을 주므로 모든 enzyme kinetics analysis는 일정한 효소농도에서 수행 Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Enzyme kinetics (기질의 농도변화에 따른 효소 반응속도) 기질의 농도변화에 따른 효소반응속도 낮은 기질농도에서는 기질농도가 커질수록 반응속도 증가, 높은 기질농도에서는 기질의 의존성이 낮아지면서 기질농도가 증가해도 효소반응이 더 이상 증가하지 않음 : 포화효과 (saturation effect) Michaelis-Menten kinetics equation V0 = Vmax [S] Km + [S] Vmax = maximum velocity V0 = initial velocity [S] = substrate conc. Km = Vmax /2 일 때 기질농도 Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Lineweaver-Burk plot (Double-reciprocal plot) V0 = Vmax [S] Km + [S] 1 Km 1 1 = · + V0 Vmax [S] Vmax y = ax + b Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Enzyme inhibitors Competitive inhibitor : 저해제가 기질과 유사하여 효소와 경쟁적으로 결합하는 경우 일반적으로 기질과 구조적 유사성을 가지는 물질이거나, 반응 산물인 경우 억제효과가 기질 농도에 좌우됨 (기질농도가 높을수록 억제효과 줄어듬) Non-competitive inhibitor : 저해제가 효소의 기질 결합부위와 다른 곳에 결합하여, 기질 결합부위의 (비) 구조적 변화를 일으켜 효소의 활성을 억제하는 경우 효소의 농도가 감소한 효과 Umcompetitive inhibitor : 저해제가 ES complex에 결합해 효소의 반응을 저해하는 경우 (반, 무) Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Competitive inhibitor Vmax 안변하므로 : y절편은 그대로 Km 커지므로 : x절편은 증가 1 Km 1 1 = · + V0 Vmax [S] Vmax 정상효소농도감소 : 반응속도 감소 → 즉, Vmax 감소 기질이 결합부위에 오는걸 막을 때 (똑같은 반응속도를 내기 위해서 더 많은 기질농도 필요) → 즉, Km 증가 경쟁적 저해제 존재하의 Lineweaver-Burk plot Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Non competitive inhibitor Vmax 감소하므로 : y절편은 증가 Km 그대로이므로 : x절편이 그대로 1 Km 1 1 = · + V0 Vmax [S] Vmax 정상효소농도감소 : 반응속도 감소 → 즉, Vmax 감소 기질이 결합부위에 오는걸 막을 때 (똑같은 반응속도를 내기 위해서 더 많은 기질농도 필요) → 즉, Km 증가 비경쟁적 저해제 존재하의 Lineweaver-Burk plot Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Uncompetitive inhibitor Vmax 감소 : y절편은 증가 Km 작아지므로 : x절편 감소 1 Km 1 1 = · + V0 Vmax [S] Vmax 정상효소농도감소 : 반응속도 감소 → 즉, Vmax 감소 기질이 결합부위에 오는 속도가 더 빨라짐 (르 샤틀리에의 원리) E+S와 ES 농도차가 더 커지므로 → 즉, Km 감소 르 샤틀리에의 법칙 : 평형조건에서 평형이 깨졌을 때 평형은 변화를 완화시키는 쪽으로 이동한다는 원리 무경쟁적 저해제 존재하의 Lineweaver-Burk plot Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Experimental method Alkaline phosphatase라는 enzyme을 이용하여 효소반응속도를 학습한다. (무색) (밝은 노랑) Alkaline phosphatase(ALP) ρ-Nitrophenylphosphate(PNPP) : no color ρ-Nitrophenol(PNP) : bright yellow , 410nm에서 최대흡광 즉, PNPP에 ALP를 처리하면 PNP(노랑)가 형성 ALP의 처리시간을 달리하여 흡광도를 측정하면 PNPP(반응물)에서 PNP(생성물)로의 ALP의 효소반응속도 를 측정할 수 있음. 농도를 측정할 수 있는 거라면, Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Procedure 준비물 Spectrophotometer Enzyme : calf intestine alkaline phosphatase Substrate : ρ-nitrophenylphosphate (10mM) Unknown inhibitor A (1mM) Reaction buffer : 100mM Tris-HCl, 2mM spermidine, 0.2mM ZnCl2, 2mM MgCl2 Stop buffer : 100mM NaOH Stopwatch D.W (distrilled water) 농도를 측정할 수 있는 거라면, Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Procedure 실험과정 1) spectrophotometer의 wavelength를 410nm로 맞춘 후, reaction buffer, DW, enzyme만 넣어 BLANK를 잡는다. 2) 각 기질의 농도별로 e-tube를 준비한다. e-tube에 reaction buffer, DW, substrate를 순서대로 넣는다. (table 참고) enzyme(ALP)은 최종적으로 첨가하면 반응이 시작된다. 0분, 1분, 2분, 3분 간 상온에서 반응을 수행한다. 3) 일정시간 반응 후, 100μl의 1M NaOH 용액을 첨가하여 반응을 중단시킨다. 4) 반응용액을 cuvette에 옮긴 후 Spectrometer에서 O.D.(A410) 를 측정한다. 5) O.D. 값을 PNP의 농도를 전환시킨 후, 각 기질농도에서의 Vo값을 구한다. (참고: PNP= 18300 M-1cm-1) 6) Lineweaver-Burk plot을 그리고 Vmax와 Km값을 구한다. 7) 위와 동일한 반응을 inhibitor A를 첨가한 후 수행한다. 8) Inhibitor A의 inhibition mode를 결정한다. 농도를 측정할 수 있는 거라면, Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Result 1. 3. 1번과 2번 결과에 대한 Lineweaver-Burk plot 4. 각각의 Vmax와 Km 값. 5. inhibitor A의 inhibitor mode 2 3 2. 2 3 Development & Cell Differentiation Lab.

Development & Cell Differentiation Lab. Report 작성법 반드시 Hand writing 으로만 작성 하시길 인터넷 등 각종 자료를 복사하는 경우 책임 못 짐 Discussion 은 알차게 1페이지 안쪽으로 작성 자료 인용 시 반드시 Reference 달 것 본인의 학번과 이름을 반드시 기재 부탁드림 미제출시 깔끔하게 0점 처리(제출시 최하 7점) 기타 수업 및 레포트 관련 문의는 - dicafree5@korea.com (S338호, 070-7561-5697, 010-9957-4987) 8. 공지사항~!!! (다음주 실험에 드라이기 지참! / 금요일반 10시 시작!) Development & Cell Differentiation Lab.