분자표지 개발의 원리 박 영 훈 유전체시대 채소육종전문가 교육워크샵 부산대학교 원예생명과학과 Department of Horticultural Bioscience 유전체시대 채소육종전문가 교육워크샵 분자표지 개발의 원리 박 영 훈 부산대학교 원예생명과학과

■ 목차 I 분자표지의 원리 - 염기서열 변이의 종류 - 염기서열 변이의 판별 II 분자표지의 종류 - 분자표지 종류와 특성 - 분자표지의 특성비교 (RAPD, AFLP, SSR…) III 분자표지의 활용 - 핵산지문법과 유전자지도 작성 - 분자표지이용 여교잡 - 형질연관표지와 간접선발 (NIL, BSA)

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 분자표지개발에 사용되는 염기서열변이 (DNA 다형성) Single nucleotide mismatch (substitution) (단염기치환) Insertion (삽입), Deletion (결실) Minisatillite(소부수체), Microsatillite (극소부수체) Inversion(역위), Translocation (전좌)

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 삽입/결실(insertion/deletion, In/Del) Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 단일 염기변이(single nucleotide mismatch, SNP) Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG 단순 염기반복서열(simple sequence repeat, SSR) Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 종류 단일염기서열변이 > 단순반복서열 > 삽입/결실 단일염기서열변이 > 단순반복서열 > 삽입/결실 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 판별 염기서열 변이(대립유전자)의 판별 기술 Polymerase chain reaction (PCR) Southern Blotting & Hybridization Enzyme restriction Melting curve analysis & High resolution melting Microarray 위의 기술을 조합적으로 이용하기도 함

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 판별 PCR을 이용한 대립유전자 증폭과 염기서열 변이의 판별 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 판별 제한효소 처리를 이용한 염기서열 변이의 판별 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA PstI Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT EcoRI

■ 분자표지의 원리 염기서열 변이의 판별 PCR과 제한효소 처리를 동시에 활용한 염기서열 변이의 판별 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA PstI Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT EcoRI

■ 분자표지의 종류 분자표지의 종류와 특성 염기서열 정보 비의존적 분자표지 염기서열 정보 비의존적 분자표지 분자표지의 종류와 특성 염기서열 정보 비의존적 분자표지 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Random amplified polymorphic DNA (RAPD) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) 염기서열 정보 비의존적 분자표지 Sequence characterized amplified region (SCAR) Characterized amplified polymorphic sequence (CAPS) Simple sequence repeat (SSR) Single nucleotide polymorphism (SNP)

■ 분자표지의 종류 RAPD 유전자형 A 유전자형 B A 에서 F에 이르는 6개체의 RAPD 양상 A B C D E F GGACTCGATC 밴드 2 밴드 5 밴드 3 밴드 1 PCR 을 통해 증폭될 부분 A B C D E F 밴드 5 밴드4 밴드3 밴드2 밴드1 GGACTCGATC 밴드 2 밴드 4 밴드 5 밴드 3 프라이머 유전자형 B A 에서 F에 이르는 6개체의 RAPD 양상

■ 분자표지의 종류 AFLP DNA 시료 많은 수의 특이적인 DNA 절편들 (~100,000) NNN 어댑터1 어댑터2 DNA 단편 프라이머 1 프라이머 2 어댑터와 프라이머 서열의 특징 NNN (프라이머) 어댑터에 특이적인 서열 제한효소 절단부위 확장서열 : (1 에서 4 염기쌍) (어댑터) 두 가지 제한효소로 DNA를 완전히 절단함 많은 수의 특이적인 DNA 절편들 (~100,000) 어댑터 라이게이션 - 각 어댑터가 제한효소 절단에 의해 만들어진 DNA 끝부분에 특이적으로 결합함 각 어댑터가 서열 및 어댑터 안쪽 1~4 염기쌍 서열에특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함 PCR 증폭 + 아크릴아마이드 젤에서의 전기영동

■ 분자표지의 종류 SCAR PCR 프라이머 삽입/결실 부위 Line 1 AGGTTCCAGACTAGGGATCACAGTCAGATTTAGACAGGGATAGACAG-GACCCATG Line 2 AGGATCCAGACTA----------------TTAGACAAGGATAGACAGGGACCCATG Sequencing을 통해 알려진 두 대립유전자의 염기서열 PCR 과 전기영동을 통한 대립유전자 판별 Size marker Line 1 Line 2 Hetero 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 삽입/결실 부위를 애워싸는 PCR primer쌍으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동

■ 분자표지의 원리 CAPS PCR 프라이머 EcoRI 인식부위 Line 1 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGTGGTTATACCCATCCAGATCAGGAT Line 2 TTGATTGGGACCATACCCGACGATCGGGATGGGGATATACCCATCCAGATCAGGAT Sequencing을 통해 알려진 두 대립유전자의 염기서열 PCR 과 EcoRI 처리 및 젤전기영동 Size marker Line 1 Line 2 Hetero 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 증폭된 PCR 산물의 제한효소 처리후 DNA 절편 길이의 차에 의한 상이성

■ 분자표지의 종류 SSR PCR 프라이머 SSR 다형성 부위 Line 1 GTTAGGATCCATAGCATAGACGCGCG------TGAGATAGAGGCGGATTAGATAGA Line 2 GTTAGGATCCGTAGCATAGACGCGCGCGCGCGTGAGATAGAGGGGGATTAGATAGA Sequencing을 통해 알려진 두 대립유전자의 염기서열 PCR 과 젤전기영동 Size marker Line 1 Line 2 Hetero 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp SSR 다형성 부위를 애워싸는 PCR primer쌍으로 증폭된 PCR 산물의 전기영동

■ 분자표지의 종류 분자표지의 특성 비교 분자표지 빈도 재현성 유전자좌 특이성 기술수준 필요한 DNA 양 공우성/ 우성 활용 영역 RFLP 높음 있음 많음 공우성 B,D RAPD 낮음 없음 적음 A,B,E AFLP 보통 SSR A,B,C SNP A,B,C,E SCAR C CAPS A: 유전적 다양성 탐색, B: 유전지도작성, C: 마커이용선발, D: 물리지도작성, E: 특성유전자탐색

■ 분자표지의 활용 핵산 지문법 DNA fingerprinting 개체 유전자형 판정, 개체(품종)간 유전자형 상이성 검정 육성된 품종의 계보분석 유전자원 및 품종간 유전적 유사성 판정 육종 집단 또는 계통간의 변이량 (유전적 거리) 측정 F1 품종의 순도 검정

■ 분자표지의 활용 핵산 지문법 마커(대립유전자) 변이성검정: 다형성 지수 (PIC) PIC = 1-(∑a2+b2+…), a,b,… = 특정유전자좌에서의 대립유전자 빈도 PIC분자표지1=1-[(2/10)2+(1/10)2+…..(1/10)2]=0.84 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 분자표지 1 분자표지 1

■ 분자표지의 활용 유전자 (연관)지도 작성 Genetic linkage map 염색체 상 유전자 (표지)의 위치를 연관군 작성을 통해 탐색 다수 분자표지를 이용한 고밀도 유전자 지도 작성과 유전자 클로닝 BAC library등을 이용한 염색체의 물리적 지도 작성 및 총게놈 염기서열 분석 특정형질 연관 분자표지 개발과 이를 이용한 선발육종(Marker assisted selection) 양적 형질의 유전분석 (QTL analysis) 및 유전자좌 탐색 반복친 게놈 회복을 위한 여교잡용 분자표지 탐색

■ 분자표지의 활용 유전자 (연관)지도 작성 3개의 유전자를 지닌 옥수수의 검정교배 (삼점교배) 결과를 통한 연관지도 작성 검정교배로 얻어진 자손의 표현형 잡종양친의 배우자 유전자형 자손수 (740) 재조합을 나타내는 부위 야생형 포복, 광택, 설탕형 Lz Su Gl lz su gl 286 272 광택, 설탕형 포복형 Lz su gl lz Su Gl 40 33 lz-su 광택형 포복, 설탕형 Lz Su gl lz su Gl 59 44 su-gl 설탕형 포복, 광택형 Lz su Gl lz Su gl 4 2 포복유전자(lz) 설탕유전자(su) 광택유전자(gl) 10.7 cM 14.7 cM

■ 분자표지의 활용 유전자 (연관)지도 작성 LG IV 상동 염색체 분자표지분석(genotyping) 연관군 작성(mapping) P1 P2 F2 집단의 개체 P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8… PUSSR 1 15 PUSSR 2 PUSSR 2 19 PUSSR 3 PUSSR 3 21 PUSSR 4 20 PUSSR 5 25 PUSSR 7 PUSSR 6 11 PUSSR 7 3 PUSSR 8 27 PUSSR 9 PUSSR 8 6 PUSSR 10 LG IV 유전자지도 분리집단의 유전자형

■ 분자표지의 활용 유전자 (연관)지도 작성 LG IV 상동 염색체 분자표지분석(genotyping) 연관군 작성(mapping) F2 집단의 개체 P1 P2 P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8… PUSSR 1 15 PUSSR 2 PUSSR 2 19 PUSSR 3 4 PUSSR 3 저항성 R 21 PUSSR 4 저항성 R 20 S R S R R R S S S S PUSSR 5 25 PUSSR 7 PUSSR 6 11 PUSSR 7 3 PUSSR 8 27 PUSSR 9 PUSSR 8 6 PUSSR 10 LG IV 유전자지도 분리집단의 유전자형

■ 분자표지의 활용 유전자 지도 작성용 집단 분리집단 장점 단점 F2 BC1F1 DH RIL NIL - 집단의 육성이 단순 - 근접표지인자간 상세한 거리추정 - QTL분석시 대립유전자간 유전양식추정 반복실험 및 식물체의 유지 어려움 BC1F1 - 집단의 육성이 용이함 - 여교배육종과 연계시킬 수 있음 DH - 반복실험(연차, 장소)이 가능 - 육성이 어려움, 유전양식추정 불가능 RIL - 육성과정에서 여러 번의 조환발생으로 근접표 지인자간 상세한 거리추정 가능 - 육성에 시간, 노력 소요 - 유전양식추정 불가능 NIL - 여교배육종과 연계시키기 용이함 - QTL 특성의 정확한 평가 가능 - 유전자 연관 DNA 표지에 이용 가능

■ 분자표지의 용도 분자표지이용 여교잡 각 염색체 당 반복친-특이적 분자표지 이용시 기대할 수 있는 여교잡 효율 증진 식물육종학(고희종 외)) 각 염색체 당 반복친-특이적 분자표지 이용시 기대할 수 있는 여교잡 효율 증진

■ 분자표지의 용도 분자표지이용 여교잡 분자표지이용 여교잡을 통한 TYLCV 저항성 계통개발의 예 공여친 A X 반복친 B BC1F1 -TYLCV-R MAS (1차 FS) -반복친 게놈 회복개체 MAS (1차 BS) 500개체 BC2F1 -TYLCV-R MAS (2차 FS) -반복친 게놈 회복개체 MAS (2차 BS) 250개체 BC2F2 -TYLCV-R MAS (3차 FS) -반복친 게놈 회복개체 MAS (3차 BS) 400개체 고정계통 분자표지이용 여교잡(MAB)에 사용될 반복친 게놈 선발용 표지개발을 위한 실험

■ 분자표지의 활용 형질 연관표지와 간접선발 유전자지도 작성 없이 형질 선발용 분자표지개발 근동질 유전자계통(Near Isogenic Line, NIL)을 이용한 표지개발 표현형분리집단분석(Bulked Segregant Analysis, BSA)을 이용한 표지개발

■ 분자표지의 활용 형질 연관표지와 간접선발 근동질 유전자계통(Near Isogenic Line, NIL)을 이용한 표지개발 공여친 (DP) 반복친 (RP) M DP RP NIL X 공여친(DP) 반복친(RP) F1 M DP RP NIL BC1F1 여교잡 및 선발 BC4F1 M DP RP NIL 반복친과 근동질계통(NIL) BC4F2 근동질 유전자계통(Near Isogenic Line, NIL)을 이용한 표지개발

■ 분자표지의 활용 형질 연관표지와 간접선발 각 개체의 DNA 추출 후 표현형 범주별로 DNA bulking (P1 범주의 개체 DNA bulking = B1) (P2 범주의 개체 DNA bulking = B2) 개체수 M P1 P2 B1 B2 M B1-1 B1-2 B2-1 B2-2….. P1 H P2 표현형 개체수 RAPD를 이용한 bulked DNA 유전자형 분석 독립 개체별 재확인 P1 P2 표현형 표현형 분리집단 분석(Bulked Segregant Analysis, BSA)을 이용한 표지개발

■ 분자표지의 활용 형질 연관표지와 간접선발 수박 흰가루 저항성 표지개발을 위한 BSA 과정 및 결과의 예 PM 저항성계통 X 120개 F2 개체 PM 병리검정 11개 고저항성 14개 고이병성 F2 개체선발 선발개체들의 DNA bulking (BR, BS) RAPD (1000 primer) AFLP (12 primer 조합) SRAP (20 primer) 검정 BR BS BSA에 사용한 저항성 개체들 BSA에 사용한 감수성 개체들 M RAPD에서 bulked sample간 다형성밴드 획득 저항성, 이병성 개체를 독립적으로 마커분석하여 연관성 재확인 저항성계통: …ATTAGATGGGTAGGATTTGGACACC… 감수성계통: …ATTAGATGGGTGGGATTTGGACACC… 다형성 밴드 클로닝, 염기서열분석 RAPD 마커를 공우성 CAPS 마커로 전환

■ 감사합니다 ! 부산대학교 원예생명과학과 식물 유전체 및 분자육종 실험실 (055-350-5961) 토마토/수박 분자마커 개발 및 MAS 육종지원