섬유소 : 혈액응고에 관여 신호전달, 혈액응고, 혈소판 활성화, 단백질 중합 염색법 : 1. MSB(Martius-scarlet-blue) 염색 2. 말로리 PTAH(Mallory phosphotungstic acid hematoxylin) 염색 4. 섬유소.

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1 섬유소 : 혈액응고에 관여 신호전달, 혈액응고, 혈소판 활성화, 단백질 중합 염색법 : 1. MSB(Martius-scarlet-blue) 염색 2. 말로리 PTAH(Mallory phosphotungstic acid hematoxylin) 염색 4. 섬유소

2 랜드럼 MSB 염색 A. 동맥 내 섬유소 그물망 ( 적색 ) B. 태반조직 내에 형성된 섬유소 ( 적색 ). 아교섬유는 청색, 적혈구는 노랑색 으로 염색된다

3 1) 원리 : Hematoxylin 과 Phosphotungstic acid 를 혼합하면 Lake 를 형성하여 Muscle 의 cross Striation 에 염색되고 남은 Phosphotungstic acid ion 은 collagen fiber 에 염색된다. 2) 염색액제조 (1) PTAH(phsphotungstic acid hematoxylin, 20 : 1) Hematoxylin(CI. No. 75290) 1g + Phosphotungstic acid 20g + D.W 1000ml 각각의 염료를 증류수로 용해시키고 혼합하여 3 - 4 주 정도 공기 중에 산화시킨 후 사용한다. 즉시 사용해야 할 경우 pot.permanganate 0.2gm 을 첨가하여 인공 산화시킴 (2) 3% Pot.dichromate : pot.dichromate 3g + D.W 100ml (3) 0.25% pot. permanganate : pot. Permanganate + D.W 100ml (4) 5% oxalic acid : oxalic acid 5g + D.W 100ml Mallory's PTAH stain

4 3) 염색과정 (1) 탈 파라핀과 함수과정을 거쳐 흐르는 물에 5 분간 수세 (2) 3% Pot. dichromate 용액에 30 분간 매염 (3) 수세로써 Dichromate 색소 제거 (4) 0.25% pot. permanganate 용액으로 10 분간 반응 (5) 수세 후 5% oxalic acid 용액으로 10 분간 처리하여 과량의 pot. permanganate 를 제거 (6) 수세 후 PTAH 염색액에 슬라이를 넣고 56 ℃부란기에 2 시간동안 염색 (7) 빠르게 수세, 탈수, 투명과정을 거쳐 봉입한다. 4) 염색결과 근섬유 : 청색 교원섬유 : 오렌지색 신경과 신경교질세포의 돌기 : 청자색 핵 : 청색

5 말로리 PTAH 염색 A. 심장근육조직. 근육섬유 내의 청색의 뚜렷한 가로무늬가 관찰된다. B. 콩팥. 사구체신장염. 사구체 내에 청색의 섬유소가 관찰된다

6 Cross striation of skeletal muscle 횡문 (Cross striation)

7 종류원리 Periodic acid Methanamin-silver(PAMS) 알데하이드기로 은을 환원시키는 도은법 Periodic acid Schiff(PAS) 알데하이드기를 쉬프시약으로 검출하는 방법 Masson trichrome 염료성분의 분자량 차이를 이용. 가장 큰 염료분자인 아닐린 블 루는 교원섬유, 중간크기의 염료분자인 acid fuchsin 에 근섬유, 가장 적은 염료분자인 biebrich scarlet 에 세포질이 염색 바닥막 ( 기저막 ) 염색법의 종류와 원리 표피, 내분비, 비뇨생식기, 호흡기, 위장관 - 사구체모세혈관 ( 보우만주머니 ) 사구체신장염 - 세포증식, 백혈구침윤, 사구체모세혈관 바닥막의 비후, 유리질양 변화와 경화

8 바닥막의 구조 A. 면역형광법에 의한 피부표피 중층편평상피의 바닥막. B. 바닥판과 그물판의 모형도

9 콩팥의 여과장벽 (filtration barrier) 을 형성하는 내피세포 - 바닥막 - 발세포의 형태학적 관련 구조를 보여주는 전자현미경사진 (A) 과 모형도 (B)

10 1. Periodic acid methenamine silver(PAMS) 1) 원리 : 기저막의 탄수화물 성분을 산화시켜면 aldehyde 기가 유리되고 aldehyde 기는 Methenamine silver 와 결합하고 silver 를 환원시켜 흑색 금속염을 형성 Dubosq-Brazil: DB 용액에 고정 2) 염색액제조 (1) 0.5% periodic acid (2) Methenamine silver 정장액 3% methenamine 100ml + 5% silver 5ml 먼저 플라스크에 methenamine 수용액을 20ml 정도 넣고 silver 수용액을 혼합하면 흰색 의 침전물이 형성된다. 플라스크를 서서히 흔들어 주면서 나머지 methenamine 수용액 을 조금씩 혼합하면 침전물이 사라진다. 갈색병에 넣어 냉장 보관 (3) Methenamine Silver 사용액 Methenamine silver 정장액 30ml + 5% sod. borate(borax) 3ml

11 (4) 5% sod. borate(borax) (5) 0.2% gold chloride (6) 2% sod. Thiosulfate 3) 염색과정 (1) 탈 파라핀, 함수과정을 거쳐 흐르는 물에 수세 (2) 0.5% periodic acid 로 15 분간 산화 (3) 수세 후 silver 사용액에 넣고 56 ℃ 부란기에서 넣고 40 분후 현미경을 보면서 염색 (4) 흐르는 물에 1 분간 수세 후 Gold chloride 로 2 분간 조색 (5) 수세 후 sod. thiosulfate 로 2 분간 정착 (6) 수세 후 대조염색 (H&E) 을 하고 탈수, 투명, 봉입 4) 염색결과 기저막, endothelial cell : 흑색 핵 : 청색 나머지 조직성분 : 적색

12 Kidney x100 Kidney x400 사구체 (Glomerulus) 동맥동맥동맥동맥 세뇨관 모세혈관기저막 기저막, endothelial cell : 흑색 핵 : 청색 나머지 조직성분 : 적색

13 신장생검조직 광학현미경검사, 면역형광검사, 전자현미경검사 절편두께 -2 ㎛ 두께가 얇아야 사구체의 형태와 기저막의 비후, 세포증식등의 관찰이 용이

14 PAS 염색 1. 원리 : 기저막 구성분인 다당류를 periodic acid 로 산화하여 aldehyde 를 유리. aldehyde 와 Schiff 가 반응하여 적색의 정색반응 2. 결과 : 신사구체기저막 - 적색

15 Reagent 0.5% Periodic acid - D.W 100ml + Periodic acid 0.5gm Schiff reagent Harris hematoxylin 1% HCl alcohol 시약제조 Schiff reagent ① D.W : 192ml ② Basic fuchsin : 2gm ③ Sod. Sulfite : 5gm ④ Conc. HCl : 8ml 혼합하여 3 - 4 분 간격으로 흔든다. 10gm activate Charcoal 을 첨가하여 over night 후 Filter 하여 냉장보관

16 염색과정 1. 탈파라핀과정을 끝내고 물에 5 분간 수세 2. 0.5% periodic acid 로 15 분간 산화 시킴 3. schiff 시약으로 15 분에서 30 분간 발색 시킴 4. 흐르는 물에 5 분간 수세 5. Harris hematoxylin 으로 5 분간 핵염색 6. 수세로 과량의 염료를 씻고 1% HCl alcohol 용액으로 분별 후 10 분간 중화 7. 탈수, 투명, 봉입한다. 염색결과 PAS 양성 물질 ------ 적색 (Pituitary 의 basophil cell) 핵 ------ 청색 참고 : Schiff 시약은 냉암소에 보관하고 오래된 시약의 사용여부는 Formalin 에 1 -2 방울 적하시켜 적색으로 변해야 사용이 가능하다.

17 Basment memb. : PAS (+) Fungus : PAS (+)

18 HE 염색 루프스 신장염 (lupus nephritis). 혈관사이질과 내피세포의 모세혈관 내 증 식으로 모세혈관 속공간이 막혀있다. 호중구의 침윤과 농축된 핵붕괴 파 편들이 존재한다. 소수의 모세혈관벽은 상피밑 면역침착물에 의해 철사고리모양 (wire-loop) 의 비후를 보인다.

19 PAMS 염색 막성사구체신장염 (membranous glomerulonephritis). 사구체모 세혈관 바닥막에 상피밑 침착물에 반응하여 작은 스파이 크모양 의 돌기가 관찰된다. A. 저배율 B. 고배율 사진

20 PAMS 염색 바닥막 가장자리를 따라 출현하는 분절상 가시 (segmental spicules)

21 결합조직의 염색 (Stain of Connective tissue) MSB

22 Elastic Stain Elastic Fibers in arterial wall

23 다음은 도은법을 이용한 염색사진이다. 목적물질과 환원제가 맞게 짝지어진 것은 ? 1. 탄력섬유 – Formalin 2. 세망섬유 – Formalin 3. 탄력섬유 – silver solution 4. 세망섬유 – silver solution

24 다음 Masson-Trichrome 염색이다. 화살표가 가리키는 구조 물의 이름과 해당염료가 맞게 짝지어진 것은 ? 1. Collagen fiber – anillin blue 2. Collagen fiber – Methylene blue 3. Elastic fiber – anilin blue 4. Elastic fiber – Methylene blue