2장. 분자생물학에서의 유전적 분석 분자생물학.

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1 2장. 분자생물학에서의 유전적 분석 분자생물학

2 유전적 표기 표현형 (Phenotype) : Leu+, Leu-, Arg+, Arg- 등.
3개의 로마문자 사용 (첫 글자는 대문자). 형질의 존재 유무는 +, -로 표기. 유전자형 (Genotype) : leu+, leu-, arg+, arg- 등. 유전자 표기는 소문자로 이탤릭 체로 표기. 항생물질은 -s, -r로 표기 : Pen-s, Pen-r. pen-s, pen-r.

3 유전적 표기 leu+ / leu A- : 한 벌의 염색체내에 결함 있는 유전자(leu A-)를 가지고 있는 이배체.
Productase의 표기 : prd 산물, prd, Prd 단백질 등으로 표기함. 박테리오 파아지와 효모는 이 관례를 따르지 않음 (이탤릭,대문자 사용함).

4 돌연변이체 분리 : 복제 평판 법 Replica Plating Method.

5 영양 요구성 돌연변이체 분리: Auxotroph mutant

6 돌연변이체 :DNA 염기배열의 변화 Wild type(‘+’표기) : 정상형 Revertant type
Mutant type(‘-’표기) : 돌연변이형 ※ Allele (대립형질) : 대립형질 (정상 형)과 – 대립형질 (돌연변이 형)로 상대적인 형태(Alternative form)의 유전자. Mutation (Mutagen) Back Mutation = Reversion

7 Mutagen (돌연변이 유발물질) 물리적 요인 : α, β, γ-ray, UV, X-ray.
화학적 요인 : Acridine orange, 5-BU, 2-AP, Ethidium Bromide, Alkyl 화제. 자연돌연변이 빈도 : 10-7 ~ 10-5. 인공돌연변이 빈도 : 10-2 ~ 10-1.

8 돌연변이의 종류 완전결손 돌연변이체 (Absolute Defective Mutant) :
모든 조건에서 돌연변이 표현형을 나타냄. 염기전이 (Transition),염기전환 (Transversion), 틀 변경돌연변이 (Frame Shift Mutation). 조건 돌연변이체 (Conditional Mutant) : 항상 돌연변이 표현형을 나타내지 않고, 물리적 상태 또는 다른 돌연변이의 존재에 따라 돌연변이를 나타냄.

9 조건 돌연변이체의 종류 온도민감성 돌연변이 (Temperature Sensitive Mutant). Ts mutant : 34℃에서는 정상, 39℃ 이상에서 돌연변이 형 ※ 유전자의 이상이 아니라, 유전자 산물의 불활성화. 서프레서 감수성 돌연변이체 (Suppressor Sensitive M.) : Suppressor protein이 돌연변이체에서 결함을 보상하여 정상적인 유전자산물을 생성하여 Wild type의 형질을 나타내는 돌연변이. Suppressor protein 존재 : Wild type. Suppressor protein 결핍 : Mutant type.

10 여러 종류의 돌연변이

11 복귀(Reversion) Mutant type이 Wild type으로 전환 (Revertant).
Reversion Frequency (복귀 빈도). 102의 leu- 균 주를 최소배지에 배양 : No Colony. 107의 leu- 균 주를 최소배지에 배양 : 50개 Colony. ∴ 50 / 107 = 50 * 10-7 = 5 *10-6. Frequency value(복귀빈도 치) : 5 * 10-6. 만약 이중돌연변이체의 복귀 시 복귀빈도 치 : * 10-6)2 = 25 * = 2.5 *

12 돌연변이체의 이용 생화학적 반응 및 대사경로 기 작을 밝힐 수 있음. 돌연변이체들은 기능을 밝히는데 이용된다 :
한 돌연변이체는 하나의 기능을 나타낸다. Wild type E. coli : 저 농도의 Fe+3 이온을 이용할 수 있음 (1/100,000 M). Mutant : 고농도의 Fe+3 이온을 이용함 (1/10 M). 유전적으로 결정된 시스템이 존재함을 암시. E. coli : DNA 합성을 못하는 10 종류의 돌연변이체 분리됨. 이는 DNA 합성에 적어도 10 종류의 서로 다른 단백질이 필요함을 암시함.

13 돌연변이체의 이용 돌연변이체는 생화학적 차단을 통해서 대사경로를 밝힐 수 있다.
돌연변이체는 생화학적 차단을 통해서 대사경로를 밝힐 수 있다. Gal Gal-1-p UDP-Gal X(UDP-Glu). 14C Galactose 첨가 후 20분 마다 반응물 조사. 14C Galactose-1-Phosphate, C Uridine diphospho galactose, C Uridine diphospho glucose로 전환. If) gal K- : 세포 내 14C Galactose만 검출. gal T- : 14C Galactose-1-phosphate도 검출. gal E- : 14C Uridine diphospho galactose도 검출. galK galE galT

14 돌연변이체의 이용 돌연변이체를 이용하여 대사조절을 알 수 있다. Wild type : 배지 내에 Lactose 존재 시에,
lac Z (β-galactosidase), lac Y (Permiase), lac A (Transacetylase) 유전자가 발현됨. ※ Lactose 존재하지 않을 때는 발현되지 않음. Mutant type : 항상 세 종류의 효소를 생산함. 결론 : 유전자 발현을 조절하는 System이 있음을 암시함 대사를 조절하는 System이 있음을 의미함.

15 돌연변이체의 이용 결론 : DNA ploymerase Ⅲ은 dna E 유전자 산물이며,
돌연변이체를 이용하여 세포 내 단백질 혹은 생물학적 기능과 결속되어 있는 생화학 반응을 알 수 있다. DNA polymeraseⅠ: in vitro, in vivo에서 DNA 합성. E.coli pol A- : Polymerase 50배 감소 시 DNA 합성. (DNA polymeraseⅠ이 유일한 효소가 아님을 암시). DNA polymeraseⅡ,Ⅲ 발견. dna E Ts mutant 분리 (30℃ 정상, 42℃ 비정상). Ⅰ,Ⅱ 효소 30℃, 42℃에서 정상. Ⅲ 효소 30℃ 활성, 42℃ 비활성. 결론 : DNA ploymerase Ⅲ은 dna E 유전자 산물이며, 이 효소가 DNA 합성에 관여함을 암시.

16 돌연변이체의 이용 돌연변이체는 외부물질의 작용부위를 알려준다. Rifampicin : mRNA 합성 방해 (항암제로 사용됨).
Transcription 방해? RNA polymerase 기능(구조)이상? Rifampicin resistant mutant 분리. 2 type ①세포벽이 변형된 돌연변이체. ②RNA polymerase가 변형된 돌연변이체. 결론 : Rifampicin이 RNA polymerase 형태(구조)를 변형하여 전사(mRNA 합성)를 방해하는 것을 알 수 있음.

17 돌연변이체의 이용 돌연변이체를 이용하여 뚜렷한 연관이 없는 계(System) 사이의 관계를 알 수 있다.
Wild ⋏ phage : 대장균에 정상적으로 흡착하여 증식함. Maltose- 대장균 : 박테리오파아지 흡착 못함. 결론 : ⋏ phage 의 흡착에 maltose 대사산물 또는 다른 요인 이 관계함을 암시함. Ø 80 phage가 흡착 못하는 E. coli 돌연변이체는 고농도의 Fe+3을 요구함. 결론 : Ø 80 흡착부위와 Fe+3 이온의 수송에 관여하는 단백질이 구조적으로 관련되어 있음을 추정할 수 있음.

18 돌연변이체의 이용 돌연변이체는 단백질의 상호작용을 알려준다.

19 돌연변이체의 유전적 분석 유전자지도 (Genetic Map) : 염색체위에 유전자의 상대적 위치를 나타낸 것.
유전자 재조합 (Genetic Recombination): Genetic Map (유전자 지도) 작성에 이용. 상보성 결합 (Complementation Test) : 유전자의 종류와 수를 확인하는 데 이용. 물리적 지도 (Physical Map) : Conjugation (접합) : Hfr × F-. 유전자지도 (Genetic Map) : 염색체위에 유전자의 상대적 위치를 나타낸 것.

20 Genetic Recombination : 유전자 재조합
서로 다른 염색체 위에 있는 두 유전자 부위를 하나의 염색체 위로 조합하는 것. 두 종류의 돌연변이 Phage를 세균에 감염시켜 재조합률 및 재조합빈도를 알 수 있다. ※ 재조합 기 작은 완전히 밝혀져 있지 않음. Recombinant Frequency (재조합 빈도) : Number of recombinant phage 또는 Number of recombinant types Number of total phage Number of parental + Recombinant types

21 Genetic recombination
서로 다른 염색체 위에 있는 두 유전자 부위를 하나의 염색체 위로 조합하는 방법 (교차). 재조합 빈도 = 재조합 파지 수 / 전체 파지 수. a : arg (Argine), b : bio (Biotine). 재조합 빈도는 두 유전자의 거리에 비례한다.

22 교차 기 작 : 절단 후 부착 Two factor crosses (2인자 교차). Mating point에서 무작위 절단.
4개의 절편 (단편)이 서로 연접. 새로운 2개의 유전자 재조합이 된 염색체 형성. ※ 분자 기 작은 완전히 규명되어 있지 않지만, 절단 후 부착 (Scissors-and-tape) 기 작으로 유전자 절편이 교환되는 것으로 추정함.

23 유전자지도 작성(유전자 재조합) a+ b- 완전배지 106 104 / 106 × 100 = 1%.
a- b+ 최소배지 a b = 1%. b+ c- 완전배지 ×103 /105 ×100 = 2%. b- c+ 최소배지 2×103, b c = 2%. 따라서 유전자 배열은 만약 ac = 1%라면 유전자 순서는 c a b (2). 만약 ac = 3%라면 유전자 순서는 a b c (1). c a b a b c

24 유전자지도 작성 : 연관 법 이용

25 Three Factor Cross(다 인자 교차)
연관 법을 이용. Ⅰ의 경우 (b, c 유전자 연관) : a+c+ 재조합체 선발 : 대부분 b+. Ⅱ의 경우 (a, b 유전자 연관) : a+c+ 재조합체 선발 : 대부분 b-. 그러나 유전자 순서는 제시되지 않음. 즉 b c가 연관 되었다면 유전자 순서는 a b c 또는 a c b. ∴ 유전자지도 작성은 3인자 교차 방법을 이용 함.

26 삼 인자 교차 법 : Three Factor Cross

27 삼 인자 교차 법 Ⅲ의 경우 : 연관법의 사용. b+c+ 재조합체 선택 후 a+ 인지 a-인지 결정.
Ⅲ 의 경우 주로 a- (a- 다량출현 : a b c). Ⅳ 의 경우 주로 a+ (a+ 다량출현 : a c b). ※ 더 빠른 방법 : a+b+c+ 재조합체 빈도 측정. Ⅲ의 경우 : 2번 교차 일어나야만 a+b+c+. Ⅳ의 경우 : 1번 교차 일어나도 a+b+c+. ∴재조합 빈도가 높으면 유전자 순서 : a c b. 재조합 빈도가 낮으면 유전자 순서 : a b c.

28 상보성 시험 : Complementation test
E. coli 감염하는 T4 phage : E. coli B 균 주와 K 균 주에서 정상 plaque 형성. 돌연변이 T4 phage : 생활주기 빨라지거나 큰 plaque (r 형) 형성. T4 phage＼대장균 E. coli B E. coli K Wild type 정상 plaque rⅠ mutant r형 plaque rⅡ mutant No Growth(-) rⅢ mutant

29 상보성 시험 : Complementation test
rⅠmutant × rⅡ mutant : 정상형 plaque 형성. 유전자재조합 (Crossing Over) 현상인지? 상호보완적 인지? rⅠ rⅡ rⅠ rⅡ- rⅠ rⅡ+

30 상보성 시험 : Complementation test
rⅡA mutant, rⅡB mutant 분리. rⅡA mutant rⅡB mutant B 균 주에서 r형 plaque 형성하던 것이 정상 plaque 형성. K 균 주에서 생장 못하던 것이 정상 Plaque 형성. 혼합배양 : E. coli B 균 주에 감염 rⅡ A B A, B 유전자 연관되어 있으므로 교차가 일어날 수 없음 유전자재조합 현상이 아님.

31 상보성 시험

32 상보성 실험 결과 두 유전자는 상보적인 성질을 갖고 있다.
정상 유전자에서 생성된 단백질이 기능이 없는 부분을 보완하기 때문에 K 균 주에 감염되었을 때 정상형 plaque 형성. 동일한 지역 (A 유전자 영역 또는 B 유전자 영역)에서 변이가 일어났을 경우 상보적이지 못하므로 No Growth (비상보적).

33 상보성 법칙 법칙 Ⅰ. 만일 상보적이라면, 이들은 각각 다른 유전자에 있다. 법칙 Ⅱ. 만일 상보적이지 않다면
이들은 동일한 유전자에 있다. 최소한 이들 돌연변이 중 하나는 다른 유전자에 비해 조절부위에 있다. 적어도 돌연변이 중의 하나는 저해유전자 산물을 만든다.

34 상보적 분석의 예 9번 돌연변이 체: 시 스 우성 돌연변이(조절부위 돌연변이)
: 유전자 산물을 생성하는 개시부위에서 돌연변이가 일어난 경우. 10번 돌연변이 체 : 돌연변이체가 복제활성을 저해하는 유전자 산물을 형성함. 반 상보성 (Anticomplementation).

35 상보적 실험이란? 유전적 체계를 연구함에 있어 유전적 체계를 구성하는 유전자와 조절요소의 수를 파악하는데 이용되는 실험.
유전적 체계를 연구함에 있어 유전적 체계를 구성하는 유전자와 조절요소의 수를 파악하는데 이용되는 실험. Group Mutation A 1, 5 B 2, 4, 8 C 3, 6, 7 적어도 3개의 유전자(A, B, C)로 구성 되어 있음. Cis – dominant mutation (시스 우성 돌연변이; 9번) : 유전자산물 생산 개시 신호부위의 돌연변이.

36 대장균의 유전체계 : F+, F- Donor (웅성: Male), Recipient (자성: Female), F plasmid (Sex plasmid : 성 plasmid).

37 Hfr : High frequency recombinant
F+, F-, Hfr, F’ (4 type) 있음.

38 Plasmid DNA 란? Extrachoromosomal DNA. Doule strand DNA (ds DNA).
Covalently Closed Circle form (CCC-form). Replicon. Gene marker. F, R, Col, Ti, 2 ㎛, Tol.

39 F plasmid DNA 형태 F-, F+, Hfr, F’(4 types). 유전물질의 전달 방향. F F- Hfr F’

40 접합 : Conjugation

41 접합성 Plasmid의 전염성 : Conjugated plasmid

42 대장균의 혼합배양 : Hfr × F-

43 Hfr 웅성세포를 이용한 유전자 지도 작성 Hfr 웅성세포와 F- 자성세포 이용.
Hfr leu+ × F- leu- 혼합배양에서, F- leu+ 세포 분리될 수 있음. leu+ strs Hfr × leu- strr F-. 항생제 포함한 최소배지에서 Colony 형성. (leu+ strr F- 세포만 생존). ※ leu+ : 선택표지 (Selective marker). strr : 대조 선택표지 (Counter Selective marker). (항생제 배지에서 No Growth) (최소 배지에서 No Growth)

44 Hfr × F- 교배를 이용한 유전자 지도 작성 a+b+c+d+e+ strs Hfr × a-b-c-d-e- strr F-.
시간별로 시료를 채취한 후 Shaking. (5, 10, 15, …… 100분). Streptomicine이 포함된 최소배지에 배양. 각 유전자의 유입 (entry)된 시간을 측정하여 염색체지도를 작성할 수 있음. 유전자 이동은 1분 내에 자성세포로 이동된다. 고정 점(Fixed Point)에서 DNA 이동 시작함.

45 Wollman ＆ Jacob의 교배 실험

46 Hfr 균 주의 시간당 유입곡선

47 Hfr 균 주의 형성 방식

48 환상지도 및 Hfr 균 주의 시간당 유입곡선

49 Hfr 균 주의 비정상적 절제

50 F가 Col E1 plasmid를 이동시킬 수 있는 조건