In vitro Hepatotoxicity test 독성학 실습 2 Cell Culture MTT 2011. 5. 13.

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1 In vitro Hepatotoxicity test 독성학 실습 2 Cell Culture MTT

2 목적 Hepatotoxicity Cell culture Test
세포배양의 기본을 익히고 부착세포주 중 폐암세포주 NCI-H460의 배양법 (계대 배양)을 익힌다. Hepatotoxicity Test 간암세포주 HepG2를 이용, alcohol의 간독성 시험을 in vitro 에서 구현하여 시행하고 alcohol에 의한 세포증식 억제 양상을 그래프로 표현한다. 목적

3 Hepatotoxicity test In vivo testing, Several in vitro
assessed by histopathology is the traditional toxicology tool Several in vitro hepatotoxicity endpoints in human HepG2 cells are measured using the Cell-based Assay Cell Loss/ Cell Cycle Arrest/ DNA Degradation/Apoptosis/ Nuclear Size/ Oxidative Stress/ Stress Kinase Activation/DNA Damage/ Mitochondrial Membrane Potential / Mitochondrial Mass/ Mitotic Arrest/ Cytoskeletal Integrity

4 세포증식 판정법 세포증식 분열로 인해 세포의 수가 늘어나는 상태. 세포의 가장 기본적인 기능상태를 나타내는 지표의 하나. 세포증식 판정법 세포수 계측 증식의 전제가 되는 현상의 해석 : DNA 합성 정량, DNA 복제세포 label, 세포주기 관련 단백질 검출 증식결과로서 세포량 증대를 해석 : MTT assay (비색법), 총 DNA량 정량, 총 단백질 량 측정

5 Methods for counting viable cells
A simple way to evaluate cell membrane integrity Not sensitive, and cannot be adapted for high-throughput Screening Trypan blue Radioactive substances - tritium-labeled thymidine ([3H]dThd) - accurate but time-consuming and involves handling of radioactive substances MTT assay WST-1 2. Radioactive substances The principle of this assay is: A certain number of cells is seeded in the wells of a 96 well plate. At the same time either a proliferation affecting agent is added or not. The cells are incubated for a certain time (e.g. 24 h) at 37캜. Then 3H-Thymidine is added to the wells and incubated for another period of time (e.g. 24h). Cells that are incubated without any growth inhibiting agent will grow: during each cell division the cells will incorporate 3H-Thymidine into its DNA. The more cell divisions (or the higher the proliferation rate) the more radioactivity will be incorporated into DNA. Cells that are incubated in the presence of the growth inhibiting agent (e.g. TNF-alpha will incorporate less radioactivity. After incubation the cells are harvested: during harvesting, the cells are washed out of the wells of the 96 well plate with bidest water: the cells and organelles burst and the cell's DNA is set free. The cell fragments and DNA are passed through a filter membrane (glassfiber). Only particles of smaller than 1,5 탆 can pass the filter. So, intact DNA (with a fragment length in the range of milimeters or even centimeters) will not be able to pass the filter but be collected on the filter membrane. The higher the proliferation rate of the cells was during incubation, the more cells are harvested and the more radioactive DNA will be collected on the filter. The filter membrane is dryed and the amount of radioactivity (what corresponds to the number of cells in the well or the number of cell divisions during incubation) is counted in a scintillation counter. To calculate the inhibition of proliferation in presence of a growth inhibitor you compare the counted radioactivity (counts per minute = cpm) of cells that were not treated, cpm (untreated), with the cpm in cells that were treated with agent, cpm (treated): Inhibition of Proliferation [%] = [cpm (untreated) - cpm (treated)] / cpm (untreated).

6 Cell proliferation assay (MTT)
A colorimetric assay MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] - a tetrazole, one of many categories of chemical structures is reduced to purple formazan in the mitochondria of living cells This reduction takes place only when mitochondrial reductase enzymes are active (viable cells)

7 Cell proliferation assay (MTT)
An increase in cell number results in an increase in the amount of MTT formazan formed and an increase in absorbance To determine if particular drugs or conditions effect cell growth or cell death Solutions of MTT solubilized in tissue culture media or balanced salt solutions are yellowish in color purple MTT formazan crystals are insoluble in aqueous solutions MTT test principle Viable cells depend on an intact mitochondrial respiratory chain and an intact mitochondrial membrane. Toxic agents can be identified using mitochondrial dehydrogenases from viable cells. The MTT assay is usually performed with adherent cell cultures using a culture medium free of phenol red and of serum. MTT I solution is a supra-vital dye that is metabolized by the cells (incubation period 3 hours). MTT is a tetrazolium salt (yellowish) that is cleaved to formazan crystals by the succinate dehydrogenase system which belongs to the mitochondrial respiratory chain, and is only active in viable cells. The mitochondrial succinate dehydrogenase reduces the MTT crystals into purple formazan in the presence of an electron coupling reagent. The more viable cells are present in a well, the more formazan dye is produced. After solubilization of the MTT crystals with the solubilization solution MTT II, the amount of dyeis measured spectrophotometrically at 540 nm. - The average volume of cells per well is 100 μL. To determine the best number of cells for the assay, draw first a calibration curve at least in duplicate and select the value that gives you an absorbance between 0.75 and 1.2." The crystals can be dissolved in acidified isopropanol The resulting purple solution is spectrophotometrically measured

8 세포증식 그래프 그래프 그리기 O.D. value → % 로 표현 (Control을 100%로 놓는다)
평균 값으로 그래프를 그린다 (EXCEL 함수: “AVERAGE”) 표준편차도 오차막대로 나타낸다 (EXCEL 함수: “STDEV”) 결과를 해석한다 mM/% 1 2 3 Mean SD 103 100 97 100.00 3.00 30 81 90 84 85.00 4.58 60 61 63 57 60.33 3.06 45 37 41 41.00 4.00 120 38 39 29 35.33 5.51

9 세포 배양 (Cell culture) 사람을 포함한 동물의 세포를 생체조직이 아닌 각각의 조건-
영양, 전해질, pH, 온도, 산소,이산화탄소, 습도 등-이 충족된 인공배지에서 증식하게 하여 세포의 형태학적 관찰, 기능에 관한 연구, 각종 질환의 진단 및 관련 유전인자의 확인, 항암제 효능평가, 유전자 치료에 이르기까지 다양한 학문분야에서 기본적으로 활용되는 기술임.

10 배양 재료 및 조건 배지 (Medium) 배지 완충액 혈청 항생제 : 세포나 조직이 생리적 조건을 양호하게 가지고 정상적인
기능을 영위하기 위해 사용되는 배양액으로서 기본 영양소로 아미노산, 비타민, 미네랄, glucose등을 풍부하게 포함하고 있다 (오염주의) 배지 (Medium) 대표적 배지 종류 색: 지시약 Phenol Red 때문에 붉은 색을 띤다. 자주 (pH7.8), 빨강 (pH7.4), 오렌지 (pH7.0), 노랑 (pH6.5) 세포의 성장에 따른 유산 분비와 CO2의 공급으로 배지가 산성이 되면 노랗게 변한다. Eagle’s medium BME (Basal Eagle’s medium)/ MEM (Minimum Essential medium)/ DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 접착성 세포주의 molecular work용으로 적당 RPMI medium RPMI 1630/ RPMI 1640 미국의 Rosewell Park Memorial Institute에서 개발). 환원제를 포함하여 부유세포 배양에 적당 Ham’s medium F10/ F12 Amino acid농도가 낮으며 많은 세포의 colony 증식이나 초대배양에 이용됨 초기에는 체액에 기초한 자연배지로 시행함 각 cell line에 맞는 배지들이 개발됨

11 배양 재료 및 조건 완충액 혈청 배지 완충액 혈청 항생제 배지의 pH를 안정적으로 유지하기 위해 사용 (Buffer)
대부분 Cell line의 최적 pH는 7.4이다. 배지의 pH를 안정적으로 유지하기 위해 사용 주로 NaHCO3가 이용되며 HEPES buffer 도 pH7.2~7.6에서 강력한 완충제임 완충액 (Buffer) 일반적으로, Fetal Bovine Serum (FBS)을 배지에 5~10% 첨가 역할; 영양성분, 비타민, 미량 금속, 호르몬, 세포성장인자, 접착인자의 공급 등 세포성장을 위한 물리 화학적 환경의 최적화 유의점; mycoplasma, virus, 프리온 감염의 위험 혼재 혈청 (FBS)

12 배양 재료 및 조건 항생제 배지 완충액 혈청 항생제
감염, 오염을 최소화하기 위해 사용하나 절대적이진 않다 단점 : 저항성 단백질의 발현을 조장할 수 있고 Mycoplasma의 감염 확인을 방해할 수 있다 항생제 (Antibiotics) 세포배양 시 주로 사용되는 항생제 Application Amphotericin B Fungi, yeast Ampicillin Bacteria G+/- Ciprofloxacin Mycoplasma Polymixin B Bacteria G- Penicillin Bacteria G+ Streptomycin

13 배양 환경 무균 환경 CO2 온습도 무균실험대 (Clean bench, UV 살균등)
세포 조작 시 화염 멸균, 알코올 소독 철저히 이산화탄소 배양기 : 배지의 완충액과 CO2가 반응하여 pH를 안정적으로 조절 5% CO2 유지 CO2 100% 습도와 37℃ 유지 낮은 온도보다 높은 온도가 더 심각한 문제를 야기함 온습도

14 세포주 확립 세포배양을 위한 세포의 불멸화 (무한 증식능) 암유래의 세포 유전자 도입 ex) hTERT
90%의 암세포에서 telomerase가 활성 p53, pRB등의 불활성 분화능을 비교적 안정적으로 유지 세포배양을 위한 세포의 불멸화 (무한 증식능) 유전자 도입 ex) hTERT hTERT(human telomerase 촉진 유전자) 의 실험실적 발현으로 무한수명성 획득 Virus에 의한 불멸화 ex) SV40 SV40 (simian virus 40) : 암억제유전자인 p53, pRB등의 불활성화 유도 자연적 형질전환 ex)설치류의 세포 설치류는 telomere가 인간에 비해 5배 이상 길며 telomerase의 발현이 비교적 쉬움 p53의 자연발생적 변이가 발생 저산소 조건 등 산화적 스트레스에 취약 일부 분화능력 상실 가능

15 세포주 “HepG2” HepG2 HepG2 <HepG2> <Floating cells>
세계에서 12번째로 많이 사용 되는 세포주 Origin : 15 year old Caucasian American male Epithelial morphology (부착 세포주) 다양한 혈장단백들을 분비 : e.g., albumin, transferrin fibrinogen, alpha 2-macroglobulin, alpha 1-antitrypsin, transferrin and plasminogen. HepG2 <HepG2> <Floating cells> <NCI-H460>

16 계대 배양 (Sub culture) 필요성 1 2 3 Contact Inhibition 대량생산 동결보존과 해동
세포가 증식하여 배양용기에 가득 차게 되면 증식을 정지하고 세포사멸에 빠지게 됨 2 대량생산 세포주 (Cell line)를 대량으로 증식시켜 반복실험에 사용 3 동결보존과 해동 증식중인 세포를 동결하여 장기간 보존가능하며 동결 보존중인 세포를 해동하여 계대배양 가능

17 계대 배양 (Sub culture) 세포 증식의 4단계 Lag phase (유도기) Logarithmic phase
(대수증식기) Stationary phase (정체기) Death phase (사멸기) 세포박리에 의한 손상을 회복해서 새로운 환경에 적응하기 위한 시간 세포가 활발히 증식하는 시기 세포밀도의 상승, 영양분의 고갈, 노폐물의 축적 등으로 증식 정지 정체기를 지나 세포가 서서히 사멸하게 됨

18 계대 배양 (Sub culture) 원칙 1 2 3 Timing 희석률 세포의 박리 세포가 왕성한 상태 에서 새로운 환경에
적응할 수 있도록 Logarithmic phase 의 중간정도에 실시 (70%정도의 subconfluent 일 때)) 2 희석률 1:4~16 정도로 희석해서 접종 (1Ⅹ104 ~1Ⅹ105 cells/mL) 3 세포의 박리 접작성 세포주의 계대 배양에는 효소처리법 (0.2% Trypsin/0.02% EDTA) 혹은 물리적 박리법 (scraper 사용) 을 이용할 수 있다

19 배양 과정 PBS 세척 T/E로 세포박리 Trypsin의 활성 정지 원심분리 희석 후 계대
남아있는 배지와 dead cells, debris 등 제거 목적 T/E로 세포박리 단백질에 의한 접착을 trypsin으로, Ca2+을 통한 결합을 EDTA로 chelation하여 세포를 바닥에서 분리하고 세포끼리의 결합도 하나씩 분리한다. Pipeting으로 인한 물리력도 이를 돕는 역할을 한다. Trypsin의 활성 정지 FBS가 들어간 배지를 첨가하면 trypsin의 활성이 정지된다 배지 첨가 후 pipeting으로 물리력을 가하여 single cell 로 만든다 원심분리 세포가 파괴되지 않도록 원심분리 1500~2000 rpm (1500g 이내) 희석 후 계대 세포수를 측정하여 희석 배수를 정하고 새로운 배지에 계대한다

20 세포수 계산 세포수 계산법 cells/ml = average count per square × dilution factor × 104 Total cells = cells/ml × total original volume * The number 104 is the volume correction factor for the hemacytometer: each square is 1×1×0.1 mm.

21 REPORT MTT 결과 (세포증식 그래프)와 고찰
MTT 이외의 여러가지 In vitro 간독성 시험법 : 종류와 간단한 원리 3장 내외로 5월 27일 (금) 까지 제출 (다음실습은 6월 중)

22 재료 준비 조별 받아갈 재료들 Alcohol (ethanol) 120 mM 1mL
Positive control - MTX (Methotrexate) 500 ppm PBS 1mL e-tube 조당 4개씩, e-tube rack Micropipet 1000/200 조당 하나씩 pipet tip 200/1000 Tip waste tube (50mL tube) * 96 well plate ; 실험 직전에 incubator에서 꺼내 받기