Chapter.20 DNA sequencing을 이용한 지중해성 빈혈의 원인.

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1 Chapter.20 DNA sequencing을 이용한 지중해성 빈혈의 원인

2 1.검사의 배경 (1)질환의 특징 =지중해성 빈혈은 일반적으로 혈색소를 구성하는 ß -globin 사슬의 생산이 감소함으로써 발생하는 우성 유전성 혈색소 질환(ß-Thalassemia)을 말함, 혈색소를 분석하여 보면 정상적인 혈색소 HbA의 함량이 줄고, 비정상적인 혈색소인 HbA2의 함량이 높아짐 (2)유전자의 특징 =ß -globin유전자는 단백질을 암호화하고 있는 유전자 중에서 매우 작은 유전자에 속하며 유전자의 전체길이는 약 3kb 정도이다. 모두 3개의 엑손과 2개의 인트론을 가지고 있다.

3 1. 검사의 배경 (3)동위원소의 취급 주의사항 =일반적으로는 동위원소를 사용하게 되는데 검사자는 동위원소를 사용함에 따른 별도의 동위원소 사용자 교육과 사용신고를 해야 한다. 항상 동위원소에 따른 개인의 안전과 환경의 오염을 방지해야하는 책임과 의무가 있음을 명심해야 한다.

4 2. 검사 방법 검체 ① 검체종류 : EDTA 전혈(2 mL 이상) ② 검체거절기준 및 검체 적합성 여부 - 말초혈액량이 1.0mL 이하는 부적합하다. - EDTA, ACD Blood가 채혈 후 2일 이상 경과한 것은 부적합 하다. - 응고되었거나 오염된 검체, 녹은 조직, 여러 번 동결 해동된 검체는 부적합 하-다. 2) 시약 ①Taq DNA 중합효소 및 PCR 시약 ②Primers(20 pmol/ ㎕, 0.5pmol/ ㎕) ③ThermoSequenase direct sequencing kit(USB,USA) ④Acrylamide, bis-acrylamide 등 전기영동 시약 ⑤[Iα-33P]-ddNTPs(Amersham-Pharmacia, USA) ⑥X-ray 필름

5 ※ 그림 20-1 β-globin 유전자의 염기서열 (p.292~294)
(1) 3개의 엑손과 2개의 인트론(IVS, intervening sequence)이 위치하고 있다. (2) 염기서열의 번호는 편집의도에 따라 임의로 붙임. (3) mRNA는 +1로 표시된 염기에서부터 합성이 시작되어 poly A 신호서열을 지나 종결된다. (4) 사이에 존재하는 IVS는 splicing 과정을 통해 제거된다. (5) 엑손1의 시작코돈(AUG)에서부터 아미노산을 암호화하여 엑손3의 종결코돈(UAA)에 까지 146개의 아미노산으로 구성된 β-globin을 암호화한다. (6)DNA sequencing을 위한 프라이머의 위치와 방향을 표시하였다. (7) 염기서열의 위아래로 하나의 염기를 추가하여 표기한 곳은 검사에 중요한 염기 다형성 부위이다 (232nt, C/T, 684nt, C/G, 742nt G/T, 749nt, C/T)

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8 2. 검사 방법 3) 동위원소 안전관리 ① 사용자는 동위원소의 유입 및 유출에 대한 모든 기록을 유지해야 한다. ② 사용자는 개인별 방사선 노출 추적기를 착용해야 한다. ③ 사용자는 모든 안전 착용구를 착용한 상태에서 작업해야 한다. ④ 사용자는 항상 선원으로부터 안전거리를 확보해야 한다. ⑤ 모든 폐기물은 별도의 처리 방법에 의거하여 환경에 오염되지 않도록 해야 한다.

9 2. 검사 방법 4) 검사순서 (1)WBC의 분리 및 DNA 추출: 제21장 참조 (2) 각 구역의 PCR ① 검체 당 10개의 튜브를 준비하고 다음과 같이 master mixture(45 ㎕/튜브)를 준비한다. ② Master mixture를 각 튜브에 분주하고 mineral oil 한 방울씩 가하고 얼음에 방치한다. ③ 환자 DNA와 대조 DNA를 (각 100ng/㎕) 3㎕ 가하고 1초 원심분리 한다.

10 2. 검사 방법 ④ 다음과 같이 PCR한다. -(주형 DNA의 변성) : 95℃ 3분 -(초기 PCR 주형 합성): 96℃ → 55℃ → 72℃ (각 60 초, cycles) -(PCR 증폭 과정) : 94℃ → 55℃ →72℃ (각 30초, cycles) -(최종 반응 완료) : 72℃ 5분 ⑤ 각 산물을 5㎕씩 2% 아가로스겔에서 5~10 V/cm, 20분간 전기영동 하여 증폭산물을 확인. 이때 농도를 정확히 알고 있는 표준 DNA(50ng/㎕)를 함꼐 영동하여 증폭산물의 농도를 육안비교한다. ⑥ 사용할 때까지 냉동하여 보관.

11 2. 검사 방법 (3) PCR 증폭산물의 정제 PCR 증폭산물 내에는 DNA 뿐만 아니라 사용되지않은 dNTP, 프라이머 DNA 중합효소, 완충액 성분 등이 많이 남아 있기 때문에 이들이 sequening 반응에 유입되면 비특이적인 반응이 일어남. (4) PAGE 판 만들기 ① DNA sequening 용 유리판을 준비한다. ② 작은 유리판에 sigma-Coatⓡ 1mL 을 뿌리고 kimwipers로 고루 바름 ③ 10분간 공기 중에서 말리고 70% 알코올을 분사하여 가볍게 닦아낸 후 10분간 충분히 말린다.

12 2. 검사 방법 ④ 0.4 mm spacer.를 사용하여 샌드위치를 위한 유리판을 결합, 양옆과 하단면을 sequencing용 접착테이프로 액체가 새지않도록 접착하여 막는다. 대형 집게를 이용하여 양쪽 spacer 위를 압박하여 유리판 사이의 두께가 0.4 mm를 유지하도록 고정. 유리판 샌드위치를 고정판을 사용하여 45도 정도 기울여 설치. ⑤ 다음과 같이 urea를 포함하는 DNA용 변성-PAGE용액을 만든다. -Acrylamide g -Bis-acrtlamide g -Urea g -20x glycerol tolerance 완충액 5mL -H2O to 100 mL -0.45 ㎕ pore의 주사기 용 여과기를 이용하여 여과한다.

13 2. 검사 방법 ⑥ 10% ammonium persulfate을 1mL 가하여 혼합하고 TEMED를 25 ㎕을 가한 다음 즉시 유리판 사이에 붓는다. 유리판의 사이가 매우 얇기 때문에 50mL 주사기에 18G 주사바늘을 사용하면 쉽게 제조. ⑦ 유리판을 수평으로 뉘어 놓고 “shark-tooth(Saw-tooth)” comb 의 수평면을 샌드위치에 3~5mm 정도 삽입하여 하나의 긴 well을 만듬. ⑧ 2시간 이상 방치하여 겔이 중합되어 굳게 한다.

14 USB사의 ThermoSequenase cycle sequencing kit와
2.검사 방법 (5) DNA sequencing 반응 USB사의 ThermoSequenase cycle sequencing kit와 Amersham사의 [Iα-33 P] ddNTPs set 를 이용한 방법. ① 주형 DNA의 정량 아가로스 겔에서 EtBr 염색을 통하여 표준 DNA와 비교함으로써 주형으로 사용할 DNA를 반정량함. Spectrophotometer로 측정하면 실제보다 높게 측정될 위험이 있다. ② 시약 -ThermoSequence radio-labeled terminator cycle sequencing kit, USB Corp. ThermoSequence DNA polymerase: 4U/㎕ Reaction 완충액: 260 mM Tris-Cl, PH 89.5, 65mM Mgcl2 dGTP nucleotide master mixture: 7.5 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP dTTP nucleotide master mixture: 7.5 μM dATP, dCTP, dTTP, 37.5μM dITP

15 ③ Termination mixture의 준비
2. 검사 방법 ③ Termination mixture의 준비 얼음 위에서 하나의 검체와 프라이머 당 4개의 미량원심분리기 튜브를 준비하고 각각 A, G, C, T로 표기한다. ④반응액 준비 ⑤ Cycling termination reaction 4.5 ㎕ Reaction mixture를 각각의 A, G, C, T 튜브에 분주하고 즉시 혼합. 가볍게 원심분리. PCR 기기에 설치하고 다음과 같이 반응을 진행. -dGTP를 사용한 경우 [95℃-- 30초, 55℃--30초, 72℃-- 30초] : 30회 -dITP를 사용한 경우 [95℃-- 30초, 55℃--30초, 60℃-- 5분] : 30회 ⑥ 4㎕ 정지액을 각각의 Termination reaction에 넣고 잘 혼합한 후 원심분리한다.

16 2. 검사 방법 (6) 전기영동(전기영동 완충액 : 1 x TTE 완충액) ①완전히 굳은 PAGE 겔 샌드위치를 전기영동 장치에 설치하고 위쪽과 아래쪽 탱크에 완충액을 채운다. ②comb을 제거하고 10 mL 주사기를 이용하여 Well을 청소. ③Shark-tooth comb을 깨끗이 씻어 “톱니”가 겔에 1~2 mm 정도 박히도록 조심스럽게 유리판 사이로 끼워 넣는다 ④전기영동 장치의 뚜껑을 닫고 전원공급장치에 연결한 다음 60 watts로 15분 정도 운전. ⑤정지 시약이 첨가된 sequemcing 반응액을 70℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음 얼음에 보관. ⑥전원을 끄고 comb이 만든 well을 10mL 주사기를 이용하여 조심스럽게 세척한다.

17 2. 검사 방법 ⑦ 변성된 반응액을 4㎕씩 각 well에 다음과 같은 전략으로 loading한다. 판독해야 할 염기서열의 길이가 200bp 미만일 경우는 검체 당 A, G, C, T 4개읠 well을 사용. 250 bp 이상일 경우는 시간 간격을 두어 같은 검체를 다시 옆 well에 A, G, T, C 순서로 나란히 전기영동 ⑧60 watts로 2시간 반정도 전기영동한 후 다시 같은 검체를 옆에 비워 둔 4개의 well에 ⑤의 과정을 반복한다. ⑨60 watts로 2시간 정도 전기영동 한다.

18 (7) 전기영동 겔의 건조 및 autoradiography
2. 검사 방법 (7) 전기영동 겔의 건조 및 autoradiography 전기영동이 끝나면 상층 완충액을 조심스럽게 제거하고샌드위치를 전기영동장치에서 분리한다. 3MM CHR 여과지를 유리판의 크기보다 약간 크게 잘라서 둥글게 휘어 겔의 한 가운데에 위치하고 양쪽으로 펴 겔 위를 전부 덮도록 하고 부드럽게 눌러 겔을 붙임. 유리판으로부터 겔이 붙은 3MM 여과지를 떼어낸다. 겔이 붙은 여과지를 2L의 겔 고정액에 30분간 고정한다. 겔이 붙은 여과지를 꺼내어 흡습지 위에 올려두어 물기를 없앤다. 랩을 겔 위에 붙이고 겔 건조기에 설치한다. 80℃에서 진공흡입하에 두어 30~60분간 방치한다. 건조된 겔의 빈 여과지 부분을 X-ray 필름카세트의 크기로 제단하고 암소에서 X-ray 필름을 건조된 겔 위에 덮어 카세트 안에 넣고 잠근다. 24~48 시간 방치한 다음 현상한다.

19 2. 검사 방법 (8) 결과 판독 필름 판독판 위에 필름을 놓고 두 번째 loading한 4개의 lane을 먼저 판독한다. 4개의 lane 중 A lane에서 보이는 밴드들은 그 위치에 염기 A가 있음을 의미하는 것이다. 비교해야 하는 염기서열은 반드시 사용한 프라이머 사슬 쪽 염기서열이며 well의 위치에서 가장 먼 밴드가 가장 작은 크기의 밴드이므로 프라이머의 3’-말단에서 가장 가까운 것이다. 4개 lanes의 밴드들을 크기 순서로 읽으면 그 순서가 알고자 하는 주형 DNA의 염기 서열이다.

20 ※그림 20-2 DNA sequencing을 이용한 지중해성 빈혈의 돌연변이 확인 p.302

21 2. 검사 방법 5) 결과 해석의 주의사항 6) 참고치: 음성(Negative) 7)임상적 의의 ①지중해성 빈혈
정상의 염기서열과 비교해야 한다. 4개의 lane에 모두 밴드가 보일 때는(BAFL, bands in all 4 lanes) compressin의 기능성이 있음으로 주의해야 한다. 겔의 상태에 따라 밴드들이 일정한 간격으로 나타나지 않을 때가 있음으로 주변의 다른 lane의 밴드들의 형태와 비교하면서 판독한다. 때로 밴드가 중심부위보다 외곽 쪽 lane에서 이동속도가 느려지는 소위 “smile”현상을 보여 이들 lane 에서 경사져 보이므로 밴드의 크기 비교를 함에 있어 주의해야 한다. 6) 참고치: 음성(Negative) 7)임상적 의의 ①지중해성 빈혈 ②불안정 혈색소질환

22 3. 검사의 기술적 고찰 DNA sequencing은 매우 기술집약적인 검사방법이다. 검사자의 여러 번의 반복적인 실험을 통하여 각 단계의 숙련이 필요하다. 최근에는 모세관 전기영동법(capil-lary eletrophoresis)을 이용하여 자동 검체흡입장피를 장착함으로써 실험자는 겔 샌드위치를 만들지 않고 sequencing 반응만 시행하여 그 결과를 알 수 있게 되었다.