9장. Western Blot Analysis using His-Tag Antibody

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1 9장. Western Blot Analysis using His-Tag Antibody

2 Blotting(블러팅) 1) Southern blotting
DNA분자를 아가로오스 겔(agrose gel)로부터 membrane으로 옮긴 후, 특정 DNA서열(sequence)을 probe(탐침)을 이용하여 탐지하는 방법. 2) Northern blotting Southern blotting과 같은 원리이며 DNA 대신 특정한 RNA를 탐지하는 방법.

3 Blotting(블러팅) 3) Western blotting
Immunoblotting(면역블러팅)이라고 하기도 하며 항원-항체 반응을 이용하 여 여러 단백질 혼합물 중에서 원하는 특정 단백질만을 찾아내는 방법. 원하는 단백질에 대해서 높은 특이성을 가진 항체(high-quality antibody)가 필요하다.

4 항체를 이용한 다른 실험들 1) Western blotting 2) 면역조직화학(Immunohistochemistry)
3) 효소결합면역흡수분석법(ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4) 면역퍼옥시다제 세포 염색법(Immunoperoxidase cell staining) 5) 면역형광 세포 염색법(Immunofluorescnce cell staining) 6) 면역침강법(Immunoprecipitation) 7) 유세포분석기(Flow cytometry)

5 Western blotting의 원리 전기적으로 분리된 단백질을 membrane으로 transfer하여 확인하는 방 법으로 주로 단백질이 갖고 있는 antigenic epitope와 특이하게 반응하 는 항체를 이용. 방사선동위원소로 표지되지(radiolabelled) 않은 복잡한 형태의 단백질 중에 특이한 단백질을 확인하고 정량하는데 유용. 장점 특정 단백질의 항원성을 통 해 확인가능. 단백질의 분자량 확인 가능. 소량의 단백질도 확인 가능. 2) 일반적인 blotting 실험 방법 시료(sample)준비 겔 전기영동(gel eletrophoresis) transfer to membrane blocking 항체부착 detection(검출)

6 Western blotting의 원리

7 Western blotting의 원리 3) Transfer
폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에서 단백질을(겔에서 분리된 그 대로) membrane으로 옮기는 과정. *Transfer buffer 20% 메탄올(methanol) : membrane에 단백질 결합능력(binding capacity)이 증가. *Membrane을 사용하는 이유? 항체를 이용하여 확인할 때 더 편리하다. 겔을 다루는 것 보다 편리하다. 염색(staining/destaining)이 빠르다. 장기간 보관에 용이하다.

8 Western blotting의 원리 *Transfer membrane의 종류 및 특징

9 Western blotting의 원리 4) Blocking
Membrane상에서 항체와 단백질의 비특이적 결합(non-specific binding)을 피하기 위함. *Common membrane blocking reagents 5) Wash Western blotting은 여러 가지 연속적인 과정을 거치는데 이 때 비특이적 결합을 최소화해 주기위한 과정이다. Reagent Formulation Comments Dried milk 5 % non-fat dried milk in PBS or TBS Masks some antigens Milk/Tween-20 5 % non-fat dried milk in PBS or TBS, 0.1 % Tween-20 Tween-20 0.1 % Tween-20, 0.02 % NaN3 in PBS or TBS Can stain after detection BSA 0.3–3 % bovine serum albumin, 0.02% NaN3 in PBS Lower endogenous cross-reactivity

10 Western blotting의 원리 직접방법 (Direct method) 간접방법 (Indirect method) 장점 단점
-1가지 항체만 이용하므로 빠름. -2차 항체의 교차반응 (cross- reactivity)를 고려하지 않아도 됨. -1차항체에 대한 표지(label)가 이중으로 가능. -표지물질(label)을 1차 항체에 결합시 항체의 면역반응(immunoreactivity)감소. -가격이 비경제적. -신호(signal)가 거의 증폭되지 않음. -1차 항체 표지물질의 선택폭이 적음. 간접방법 (Indirect method) -2차 항체가 신호를 증폭시킴. -여러 종류로 표지된 2차 항체를 이용할 수 있음. -한 종류의 2차 항체를 여러 종류의 1차 항체에 이용가능. -표지능(labeling)이 1차항체의 면역반응(immunoreactivity)에 영향을 끼치지 않음. -2차 항체에 따라 발현방법(detection method)을 다르게 할 수 있음. -2차 항체는 비특이적 염색(nonspecific staining)이 나타날 수 있음. -직접방법보다 추가적인 단계가 있음.

11 Western blotting의 원리 *항체 –항원과 결합하는 단백질을 말하며, 혈액과 체액에 녹아있는immunoglobulin (Ig)을 지칭. (단일클론항체, 다클론항체) *1차 항체(primary antibody) Membrane에 붙어있는 단백질 중에 확인하고자 하는 단백질의 항원을 인식하므 로 항원 특정 부위에 결합. 적절한 희석이 중요 - 원하는 단백질을 특이적으로 확인 할 수 있으며 비특이적 결합은 최소화하는 범위. *2차 항체(secondary antibody) 1차 항체를 인식하여 결합. 1차 항체에 대하여 종(species) 특이적으로 준 비. e.g) rabbit 1차항체 -> goat-anti rabbit 2차 항체 일반적으로 HRP(horseradish peroxidase)나 AP(alkaline phosphatase)같은 reporter enzyme을 포함.

12 *항체 표기방법 1.Host : antibody를 어디서 만들었는가. Antibody가 생산된 동물. 2.Anti-Target gene 3.Ig type 4.conjugate name(옵션 - 보통 2차항체 있음) 1차 항체를 표기하는 방법 ex) 마우스에서 만든 actin을 잡는 항체 중 IgG type = Mouse anti-actin IgG 2차 항체를 표기하는 방법 ex) 염소에서 만든 항체 중 mouse actin을 잡는 IgG type인데 HRP conjugation = Goat anti-mouse actin IgG (HRP)

13 발색(Chromogenic, Colorimetric) 화학발광(Chemiluminescent)
Western blotting의 원리 *확인방법(Detection method) 발색(Chromogenic, Colorimetric) repoter enzyme 기질(substrate) 반응결과 HRP (Horseradish peroxidase) DAB(3,3'-diaminobenzidine) 갈색. (니켈(Ni)이나 코발트(Co)이온 첨가시 민감도가 상승) TMB(3,3'5,5' tetramethylbenzidine) 청색 4CN(: 4-chloro-1-naphtol) 청색/흑색 AP (Alkaline phosphatase) BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium) 화학발광(Chemiluminescent) Luminol light, glow or flash Dioxetene-phosphate light, glow

14 Western blotting의 원리 발색법: 신호가 착색된 침전물형태로 형성. 화학발광법: 반응결과 빛을 방출.
BCIP는 AP에 의해 가수분해되어 인디고 염색(indigo dye)을 만드는 이합체화 반응 (dimerization)을 하는 중간체 (intermediate)를 형성한다. NBT는 이합체화 반응에 의해서 산화되어 NBT-formazan으로 바뀐다.

15 전기영동과 transfer(NC membrane 이용)
1. Electrophoresis - SDS-PAGE gel (10 %) - 1X SDS PAGE buffer (25 mM Tris-base, 1.92 M glycine, 0.1 % (w/v) SDS) 2. Transfer - Transfer buffer (23 mM Tris-base, 189 mM glycine, 20 % Methanol) - NC membrane (1) SDS-폴리아크릴아미드 겔(10%)을 틀에 굳혀서 만든다. (2) Gel caster에서 겔을 떼어낸 다음 tank에 장착하고 buffer를 채운다. (3) 시료를 loading을 한 다음 dye가 바닥에 올 때까지 전기영동한다. (4) Membrane, 종이를 스폰지 크기에 맞게 미리 자른 후 transfer buffer에 담가둔다. (5) Transfer sandwich 만든다. (-) 스폰지/ 종이/ 겔/ membrane/ 종이/ 스폰지 (+) (6) Transfer tank에 장착하고 transfer한다. : 80V, 300mA, 150분

16 확인(NBT/BCIP 이용) 3. Blocking - Blocking buffer (3 % (w/v) non-fat dried milk in TBST) 4. Binding of 1st Antibody - Primary antibody in 1% non-fat dried milk (1:500 dilution) in TBST 5. Binding of 2nd Antibody - Secondary antibody in 1% non-fat dried milk (1:2000 dilution) in TBST 6. Washing - TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% Tween 20) (1) Blocking- 3% non-fat dried milk in TBST 5ml에 membrane을 담가두고 rocker에 30분, RT(상온). (2) 1차항체 처리/TBST- 1% non-fat dried milk in TBST 5ml에 His-Ab 10μl (1:500)를 넣은 후 rocker에 30분, RT(상온). (3) Washing- 1차항체를 버리고 rocker위에서 TBST 5ml로 5분간 3번. (4) 2차항체 처리/TBST- wash하는 TBST를 버리고 1% non-fat dried milk in TBST 5ml 에 anti-mouse-AP가 달린 2차항체를 2.5μl(1:2000)를 넣은 후, rocker에 30분, RT(상 온). (5) Washing- 2차항체를 버리고 rocker위에서 TBST 5ml로 5분간 3번. (6) 확인(AP 염색)- NBT/BCIP 용액 10ml을 바로 membrane에 붓고 밴드(band)가 나타 날 때 까지 rocking. (7) 발색되는 밴드를 확인한 후에 5ml TBST로 씻어준다.

17 실험결과 CBB staining WB ECL NBT/BCIP His-p53 His-p53 pCDNA Lysate pCDNA
Pre-stained Protein size marker CBB staining WB His-p53 pCDNA His-p53 Lysate Lysate pCDNA ECL NBT/BCIP

18 Further Study (1) 항체를 이용한 실험들- 원리 및 이용 정리 (실험 당 5줄 이내)
면역조직화학(Immunohistochemistry) 효소결합면역흡수분석법(ELISA-Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 면역형광 세포 염색법(Immunofluorescnce cell staining) 면역침강법(Immunoprecipitation) (2) Western blotting 실험시 1차항체:rabbit anti-GFP, 2차항체:goat anti- Lamin-HRP를 사용하였다면 host(각 항체의), anti-Target gene, conjugate reporter enzyme을 쓰시오. (3) Monoclonal 항체와 polyclonal 항체의 특징과 차이점을 설명하시오.(5줄 이내)

19 다음주 수업 전까지(4시까지) 과S338호 앞 바구니
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