실시간 PCR(real-time PCR)법과

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1 실시간 PCR(real-time PCR)법과
호흡기 결핵 검출에 있어서 실시간 PCR(real-time PCR)법과 iTPA (isothermal target and probe amplification)법의 비교 가톨릭의대 이혜경

2 Background Diagnostic tests for tuberculosis infection
( x-ray, microscopy, culture, serology, nucleic acid amplification ) Real-time PCR : cost, complexity, cross contamination Isothermal target and probe amplification (iTPA): combination of isothermal chain amplification + fluorescence resonance energy transfer cycling probe technology (FRET-CPT) We evaluated diagnostic performance of the iTPA in comparison with real-time PCR in respiratory specimens

3 Isothermal target & probe amplification (iTPA™)
Legend DNA RNA RNase H F FAM Q DABCYL Two pairs of primers ( DNA-RNA chimeric primer) DNA polymerase : 5’-exonuclease 활성이 제거되어 strand displacement RNase H 효소-RNA-DNA hybrid에서 RNA만 선택적으로 가수분해 Seqeunce specific signal probe annealing iTPA 기술은 PCR 기술과 차별화하여 일정온도에서 핵산 및 형광신호 프로브를 동시에 증폭하는 혁신적 기술로 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머와 신호 프로브를 사용하여 5’-exonuclease 활설이 제거된 polymerase 효소와 DNA-RNA 하이브리드에서 RNA만 선택적으로 가수분해하는 RNase H 효소를 이용하여 신속하게 핵산과 형광신호 프로브를 증폭하는 기술입니다. 본 기술의 장점은 primer와 probe의 annealing, 효소의 활성 그리고 가수분해된 신호 probe의 denaturation이 같은 온도에서 일어나기 때문에 thermal cycler 와 같은 특별한 장비 없이 신속하게 핵산검출이 가능한 기술입니다. Q F F Q

4 Materials From February 2011 to August 2011, a total of 192 respiratory specimens for MTC were evaluated. Specimens No. of Samples Sputum 148 Bronchial washing fluid 14 Pleural fluid 19 Others 11 Total 192

5 Methods Real-time PCR assay (Advansure TB/NTM; LG Life sciences, Seoul, Korea) results were compared with those of iTPA (RapiDx Mycobacterium tuberculosis test; GreenCross MS, Seoul, Korea). Cases showing discrepancy between RT-PCR and iTPA were confirmed by PCR (MTB-ID®V3; M & D, Korea).

6 일정온도에서 핵산의 증폭이 가능하여 thermal cycler 없이 간편하게 핵산을 증폭 가능
The operating of iTPA™ system Nucleic acid isolation Isothermal amplification Fluorescent detection 일정온도에서 핵산의 증폭이 가능하여 thermal cycler 없이 간편하게 핵산을 증폭 가능 양성대조액의 F-score 가 100 이상 : 유효 판정 : F-score가 ≥50 이면 양성, <50 이면 음성으로 판정

7 Real-time PCR 양성 검체 vs. iTPA
성명 rt-PCR (Ct) iTPA ( F-score) 박OO co-infec. 27 유OO 31.69 28 31.53 고OO 33.80 김OO 32.66 34 손OO 32.14 42 cut-off N=77 Sputum : 4 , bronchial washing fluid : 2 (iTPA 에서 음성)

8 Real-time PCR 음성 검체 vs. iTPA
cut-off N=115 Sputum : 4 ( iTPA에서 양성)

9 Conventional PCR 확인 성명 rt-PCR결과 PCR결과 iTPA결과 비고 원OO TB 음성 TB TB (72)
NTM NTM 판정

10 Real-time PCR + PCR Positive Negative iTPA 71 1 6 114 Consistency of presumed MTC positive specimens: 92% Consistency of presumed MTC negative specimens: 99% Positive predictive value: 99% Negative predictive value: 95%

11 Conclusions iTPA could be a cost-effective(fluorometer), easy, and rapid method to perform in comparison with real time-PCR. High specificity for the identification of MTC from respiratory specimens.