디스크확산법에 의한 항균제 감수성 검사 ; 항균제 감수성 시험의 목적은 감염증 치료에 사용할 항균제의 효과를 예측하는 것이다.

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1 디스크확산법에 의한 항균제 감수성 검사 ; 항균제 감수성 시험의 목적은 감염증 치료에 사용할 항균제의 효과를 예측하는 것이다.
희석법(액체배지 희석법, 우무배지 희석법) ; MIC최소발육억제농도, MBC 최소살균농도를 알 수 있다. 2) 디스크 확산법 ; 변법 Kirby-Bauer법, CLSI법 3) ß –lactamase 시험 ; ß-lactamase계 즉 penicillin이나 cephalosporin계에 내성이 있는지를 신속하게 검사하는 방법. 4) E – Test ; 항균제가 들어있는 strip을 사용하는데 희석법이 아니면서 MIC를 알 수 있다. 5) 디스크 근접시험 (D- zone test) ; 유도성 clindamycin 내성을 검출할 수 있다.

2 그림 10－5. Caliper나 자를 써서 mm로 억제대의 지름은 잰다.

3 국시문항 디스크 확산법 항균제 감수성검사 결과에 미치는 각종인자를 설명한다.
McFarland No. 0.5에 해당하는 표준혼탁액을 제조한다. Muller-Hinton배지를 제조한다. CLSI법에 디스크 확산법을 실시하고 결과를 판독한다. 액체배지에서 MIC 판정 MRSA 판정법 VRE 판정법 ESBL 판정법 ß-lactamase 판정법 2. 최소억제농도(MIC)측정 1) 액체배지희석법

4 1. 항균제 감수성검사 결과에 미치는 각종인자를 설명한다. (디스크확산법)
배지의 오류 : 디스크 확산법에는 흔히 Muller-Hinton 한천이 사용되며, 한천의 두께가 틀리거나 배지의 성분이 잘못되면 오류가 생길 수 있다. 특히 한천의 두께는 매우 중요하므로, 반드시 4 mm인 것을 확인해야 한다. (1) 한천의 두께가 4 mm보다 얇으면, 디스크의 항균제가 더 빠르고 넓게 확산되므로 억제대의 크기가 더 커지고, 이에 따라서 내성균주를 감수성으로 판정할 우려가 있다. (2) 한천이 두꺼우면 항균제가 느리고 좁게 확산되므로 억제대 크기가 작아지며, 따라서 감수성균주를 내성으로 판정할 우려가 있다.

5 2) 디스크의 오류 : 디스크의 역가가 수송이나 보관의 잘못 혹은 오랜 보존에 의해서 변성되면 감수성 균주를 내성으로 잘못 판정할 수 있다. 3) 시험균주의 오류 : 시험균주가 오염되었거나, 접종 균액의 탁도가 잘못되면 감수성 시험결과의 오류를 유발할 수 있다. (1) 오염이 있는 경우에는 억제대가 이중으로 나타나는 경우가 많다. 즉, 결과 해석 시 이중의 억제대가 관찰되면 오염을 의심하고, 균종 동정부터 다시 시험하는 것이 좋다. 한편 항균제에 따라서 감수성 시험 결과가 (2) 균주의 접종량에 영향을 많이 받을 수도 있다. ; 접종 균액의 탁도가 너무 높으면 억제대가 좁아질 수 있으며, 반대로 탁도가 너무 낮으면 억제대가 커질 수 있다.

6 4) 참조균주(표준균주)의 오류 : 참조균주가 오염 혹은 변이되면 그 날 시험한 감수성 결과 모두를 믿을 수 없게 되므로 주의해야 한다. 5) 배양 조건의 오류 : 배양온도 혹은 환경에 의해서 감수성 시험결과가 영향을 받을 수 있다. 특히 CO2 농도가 높은 환경에서 배양하면 CO2에 의해서 항균제의 역가가 감소할 수 있으므로 주의해야 한다. 6) 검사자의 오류 : 억제대 측정, 기록 혹은 breakpoint의 잘못된 적용에 의해서 오류가 생길 수 있다.

7 2. McFarland No. 0.5에 해당하는 표준혼탁액을 제조한다.
1%sulfuric acid(H2SO4) 99.5ml에 1.175% barium chloride dihydrate(BaCl2.2H2O)용액을 0.5ml 첨가하여 제작한다. 0.5 McFarland 표준탁도에선 625nm의 흡광도가 0.08~0.13수치를 보여야 하며, 동일한 흡광도를 가지는 대조 균주 희석액을 고체배지에 도말하였을때 형성되는 집락의 밀도가 108 CFU/ml이어야 한다. (3) 사용하기 전에 시험관을 흔들어서 barium sulfate의 흰 침전물이 잘 섞이게 한다.

8 3. Muller-Hinton배지를 제조한다.
; pH 7.2~ 7.4, CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute)항균제 감수성 시험용) Beef, infusion g Casamino acid(질소원) g Starch g Agar g 증류수 ml ; 39g을 증류수에 부유시키고 가열하여 녹이고 121oC에 15분간 멸균 후 50oC항온수조에 식혀서 petri접시에 붓는다. 디스크 확산법 감수성 시험용은 두께가 4mm되게 부어야 한다.

9 4. CLSI법에 디스크 확산법을 실시하고 결과를 판독한다.
기초배지로 Muller-Hinton 한천이 흔히 사용된다. 한천의 표면에 면봉으로 시험균주의 균액을 고르게 접종하고, 그 위에 항균제 디스크를 놓는다. 35oC배양시간 동안 디스크의 항균제는 주위의 한천으로 확산하므로, 디스크 바로 주변의 한천에는 항균제가 고농도로 분포하지만, 디스크에서 먼 곳의 한천에는 항균제가 낮은 농도로 분포한다. 이와 같은 한천의 항균제 농도경사에 의해서 세균 증식의 억제대가 형성된다. 디스크 확산법에서는 이 억제대의 지름을 측정해서 균주의 시험항균제에 대한 감수성 양상을 결정한다. 디스크 확산법으로는 MIC를 측정할 수 없다. 또한 증식이 느린 세균, 혐기성 세균 등의 항균제 감수성을 측정할 수 없는 단점이 있다. 시험이 간단하고, 비용이 적게 들며, 시험항균제를 수시로 바꿀 수 있는 장점이 있다.

10 Disk diffusion test & MIC method for Streptococcus sp.
< 검사방법 > - 검사하려는 균 집락 1개를 멸균된 식염수로 MacFarland Standard 0.5에 맞춘다. 면봉으로 MHA에 균을 바르고 항생제 디스크를 놓는다. - Disc Dispenser로 Disc를 접종한다. - 각 Disc간의 간격은 24mm 이상, 평면 가장자리로부터 15mm이상 유지한다. - CO2 없는 35도시 Incubator에서 16-18시간 배양후 억제대의 직경을 측정한다. ( Caliper나 template (동그라미 그린자)를 반드시 사용한다) 억제대 판독시 균종별로 판정기준이 다른 점을 주의 한다 ; 감수성(susceptible), 중간내성(Intermediate), 내성(resistant) Antimicrobial Agent 약어 Disk Content Zone Diameter, Nearest Whole mm Equivalent MIC Breakpoints(ug/ml) R I S 1 Cefotaxime CTX 30ug 25 28 2 0.5 2 Clindamycin CC 2ug  15  19  1  0.25 3 Erythromycin E 15ug  21 4 Penicillin P 10U  19 20-27  28  4  0.12 5 Tetracycline Te 18 19-22 23 8 2 6 Vancomycin VA -  17  1 Disk diffusion test & MIC method for Streptococcus sp.

11 5. 액체배지희석법 (실습책 그림 참조) 액체배지를 기초배지로 사용한다. ; Mueller-Hinton broth
항균제 농도마다 1 mL 이상의 액체배지를 사용하면 macrobroth 희석법, mL를 사용하면 microbroth 희석법이라 부른다. MIC 뿐 아니라 최소살균농도 (minimal bactericidal concentration, MBC)도 측정할 수 있는 장점이 있다. 육안으로 관찰하여 증식을 억제시킨 항균제의 최소농도를 MIC로 판정하기 때문에 다른 세균에 의한 오염을 배제할 수 없는 단점이 있다. 집락육안관찰 안됨. 5) Microscan, Vitek 등 자동화된 장비는 microbroth 희석법으로 균주의 MIC를 측정하며, 많은 미생물 검사실에서 이들 자동화 장비를 이용해서 편리하게 항균제 감수성 시험을 하고 있다. ** 한천희석법 :

12 6. 액체배지에서 MIC 판정 ; 실기책 그림참조)
; 집락의 증식 상태를 육안으로 관찰하여 증식을 억제시킨 항균제의 최소농도를 MIC로 판정. a. MIC (Minium Inhibitory Concentration : 최소 발육 억제 농도) ▶ 어떤 약제에 의하여 세균의 발육이 억제되는 억제 농도. b. MBC (Minimum Bacteriocidal Concentration : 최소 살균 농도), ; 일반미생물학 내용 참조 ▶ 어떤 약제에 의하여 배지중의 균이 완전 살균되어 발육되지 않는 최소농도.

13 그림 10－6. 시험관(macrodilution broth)법에 의한 MIC시험.

14 7.1. ESBL ( Extended-spectrum ß-lactamase )
; ß-lactamase에 의한 ampicillin내성 E. coli, Klebsiella, Proteus mirabilis 및 기타 Enterobacteriae의 점 돌연변이로 인해 새롭게 생성된 ESBL은 광범위 cephalosporin제 ( 예, cefotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime, ceftazidime)와 azetreonam까지 가수분해시킨다. 현재 200종 이상의 ESBL이 발견되었으며 ESBL생성균주는 검사상 감수성일지라도 모든 광범위 Penicillin제, cephalosporin제, monobactam제에 내성인 것으로 간주해야 된다. 1. Beta-lactam 항균제 (세포벽 합성 억제, 살균성bacteriocidal 항균제(균을 사멸)) 1) Penicillin 계 Penicillin, ampicillin, oxacillin, carbenicillin, ticarcillin Pencillin binding protein (PBP)과 결합하여 세포벽 합성억제 2) Cephalosporin 계 1세대 세대 세대 세대 그람양성 그람음성 그람양성, 음성 Narrow spectrum extended spectrum PBP와 결합하여 세포벽 합성 억제 3) Monobactam : Aztreonam PBP3와 결합하여 세포벽 합성 억제 4) Carbapenem 계 : Imipenem, meropenem, panipenem PBP1, 2와 결합하여 세포벽 합성 억제 항생제중 항균범위가 가장 넓다 (특히 그람음성 균)

15 7. ESBL 판정법 나타내는 내성세균. 확인검사는 clavulanic acid에 억제대 크기가 5mm이상 커진다.
; 제 1세대 ß-lactam제는 물론 제3세대 cephalosporin 및 azetreonam에 내성을 나타내는 내성세균. 확인검사는 clavulanic acid에 억제대 크기가 5mm이상 커진다. ESBL생성균은 모든 penicillin계, cephalosporin계 및 azetreonam에 내성으로 보고한다.

16 그림 10－12. ESBL 생성 E. coli 의 DDS(double disk synergy) 시험
그림 10－12. ESBL 생성 E. coli 의 DDS(double disk synergy) 시험. ; amoxicillin-clavulanate 및 cefotaxime, ceftazidime, azetreonam 또는 cefepime 디스크간의 억제대 확대현상을 보는 시험

17 요약 그람양성균 내성 PSSA  PRSA (penicillinase)  Methicillin 사용
MRSA (PBP2a 생성, b-lactam 친화성 감소)  vancomycin 사용 증가 VRE 증가 (vanA, B 획득, vancomycin 친화성 감소) VRSA (vanA 획득) 그람음성 간균 Ampicillin, 1, 2 Cs 사용 beta-lactamase 생성  3세대 Cs 사용 증가 ESBL 생성 (E. coli, K. pneumoniae, 장내세균)  Imipenem 사용 증가 Carbapenemase 생성 (MBL, OXA type carbapenemase)

18 ESBL?/왜 검출해야하나? ESBL (Extended-spectrum beta-lactamase) : E. coli, K. pneumoniae의 ampicillin 내성 유전자(TEM, SHV beta lactamase 유전자)의 돌연변이  extended spectrum beta lactam (4세대 및 aztreonam) 항균제에 내성을 보여 ESBL라 함 ESBL의 임상적 의의 및 분리 빈도 Imipenem (carbepenem)을 제외한 모든 beta lacam항균제에 내성임 E. coli의 10%, K. pnemoniae의 20-30% 까지 분리됨 감수성 검사에서 b-lactam 항균제에 감수성이라도 내성으로 보고해야 됨  검사실에서는 ESBL 생성균의 검출이 매우 중요해졌음

19 8. MRSA 판정법 9. VRE 판정법

20 MRSA (메치실린 내성 황색포도상구균) Penicillinase 내성 페니실린 (methicillin, oxacillin) 개발 Methicillin resistant S. aureus (MRSA) 출현 임상적 의의 1. 모든 beta-lactam 항생제에 내성이다. (penicillin, augmentin, 모든 cephalosporin, imipenem, aztreonam) 2. 임상적으로 입증된 항균제는 vancomycin 뿐이다. 3. 원내감염균 중 가장 많다 4. Vancomycin 항균제 사용의 증가

21 반코마이신 내성 장구균 (VRE) 유럽: 가축사료로 Avoparcin (glycopeptide) 사용- 성장 촉진제
1986년 France 1997년 Avoparcin 사용 중지 미국: 병원에서 반코마이신 사용량 증가, Nosocomial origin 국내: 유럽형 + 미국형 1998년 반코마이신 사용량 급증과 동시에 증가 관련유전자: VanA, B, C, D, E, G VanA, B만 내성 전달됨 (Plasmid에 존재) 국내 종합병원: Enterococcus faecium: 20% 장내 상주균: 요로감염, 담도감염 환경에 강하고 자연 내성 항균제 많음 병독성이 낮지만 면역성이 낮은 환자에서 사망률 높음 법적 격리 비용 받을 수 있는 세균; 주 1회 직장 도말, 3회 음성시 까지

22 10. ß-lactamase 판정법 ; ß-lactamase계 즉 penicillin이나 cephalosporin계에 내성이 있는지를 신속하게 검사하는 방법으로 cefinase(Nitrocefin)디스크법이 많이 사용되고 있다. - ESBL(extended-spectrum ß-lactamase) ; 1세대 ß-lactamase제는 물론 제 3세대 cepalosporin 및 azetreonam에 내성을 나타내고 cefoxitin 등의 cephamycin계와 clavunic acid에 효소활성이 저해(감수성)되는 ß-lactamase를 ESBL이라고 한다.

23 Nitrocefin(Cefinase,BBL)
목적 : β-lactam계 내성 여부 확인 방법 : cefinase디스크에 물을 축인 후 시험 세균을 진하게 문지른 다음 5분 정도 관찰한다 결과 Yellow → Pink(양성)

24 항균제가 들어있는 strip을 사용하는데 희석법이 아니면서 MIC를 알 수 있다
그림 10－11. Etest법에 의한 MIC시험.

25 그림 10－13. 디스크 근접 시험, 그림 A 는 erythromycin 15 ug 과 clindamycin 2 ug 디스크사이가 20 mm 간격으로, D-zone 시험 양성을 보여 clindamycin 내성으로 판정한다.

26 1. 항균제 감수성 시험 결과에 영향을 미치지 않는 것은?
① 세균의 증식기 ② 세균의 접종양 ③ 디스크중의 항균제 농도 ④ 배지의 종류, 두께(4mm), pH ( ) ⑤ 0.85% 식염수 첨가 2. MIC농도를 알수 있는 항균제 감수성시험은? 가. 디스크 확산법 나. E- test 다. ß-lactamase 라. 희석법 ① 가, 나, 다 ② 가, 다 ③ 나, 라 ④ 라 ⑤ 가, 나, 다, 라

27 9장. 항균요법 ; 국시문항 항균제 종류 및 작용기전을 설명한다. 2. 항균제에 대한 미생물 감수성검사를 설명한다.
9장. 항균요법 ; 국시문항 항균제 종류 및 작용기전을 설명한다. 2. 항균제에 대한 미생물 감수성검사를 설명한다. ; 확산법 (CLSI 추천법) 2) 희석법 3. 항균제의 선택적 독성을 정의한다. 4. 다음 용어를 정의한다. 1) 최소억제농도(MIC) 2) 저항성(Resistance) 3) 감수성(susceptibility) 4) Break point (한계점) ;

28 1. 항균요법 항생 물질(Antibiotics) : 미생물이 생산한 2차 대사산물 중 적은 양으로 다른 세균의 성장을
억제하거나 또는 사멸시키는 물질 화학 합성제(Chemical synthetic medicine) : 인공적으로 다른 세균을 사멸 또는 성장억제 시키는 물질.  인공적이므로 부작용이 심할 수 있다. 주요 용어 설명 ① Spectrum : 항생제의 작용 영역 ② 선택독성(selective toxicity) : 숙주에게는 해가 없고 특정세균에만 약효를 보이는 항생제간의 미묘한 차이점 ③ 항생제 감수성 검사 : 원인균이 발견되었을 경우 그 세균에 효과가 좋은 항생제를 밝혀 내는 검사

29 항균제 종류 및 작용기전을 설명한다. 1. Beta-lactam 항균제 (세포벽 합성 억제, 살균성bacteriocidal 항균제(균을 사멸)) 1) Penicillin 계 Penicillin, ampicillin, oxacillin, carbenicillin, ticarcillin Pencillin binding protein (PBP)과 결합하여 세포벽 합성억제 2) Cephalosporin 계 1세대 세대 세대 세대 그람양성 그람음성 그람양성, 음성 Narrow spectrum extended spectrum PBP와 결합하여 세포벽 합성 억제 3) Monobactam : Aztreonam PBP3와 결합하여 세포벽 합성 억제 4) Carbapenem 계 : Imipenem, meropenem, panipenem PBP1, 2와 결합하여 세포벽 합성 억제 항생제중 항균범위가 가장 넓다 (특히 그람음성 균)

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31 2. Aminoglycoside계 (살균성 항균제)
Streptomyces : streptomycin, tobramycin, meomycin, kanamycin (- mycin) Micromonospora : gentamicin, sisomicin (- micin) 반합성 제제 : amikacin, netilmicin 작용기전 : 30S ribosome과 결합하여 단백질 합성억제 3. Quinolone계 항균제 : 살균성 DNA gyrase에 작용하여 DNA 복제를 억제 Ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin 4. Glycopeptide 계 항균제 : 살균성 Vancomycin, teicoplanin 세포벽 합성의 억제 그람양성세균에서 항균범위 가장 넓다 (그람음성세균에 항균력 없다)

32 5. Tetracycline 항균제 : tetracycline, 정균성(bacteriostatic), 균의 발육을 저지
30S ribosome에 결합하여 단백질 합성 억제 6. Macrolide 계 항균제 ; 정균성 Erythromycin 50S ribosome에 결합하여 단백질 합성 억제 7. Lincosamide 계 항균제 : 정균성 Lincomycin, clindamycin, 50S ribosome과 결합 8. Chloramphenicol 9. Sulfonamide, Trimethoprim 10. Metronidazole : anaerobe

33 그람양성균의 내성 S. aureus Penicillin PRSA Methicillin MRSA Vancomycin
New drugs PRSA Methicillin MRSA Vancomycin More resistant Linezolid VRSA

34 GNR 에서 β-lactam 항균제의 내성 Ampicillin, 1G/2G cephalosporins
TEM-1, 2, SHV-1 Broad spectrum β-lactamase 3G cephalosporins : CTX, AZT, CTZ ESBL in Germany, 1983 AmpC beta lactamase Carbapenems : IMP, MEM MBL in Japan, 1991 OXA carbapenemase in Scotland, 1985 Narrow spectrum (1ST Cs) Cephalothin Expanded spectrum (2nd Cs) Cefamandole, cefoxitin Broad spectrum (3rd Cs) Cefotaxime, Ceftazidime) Extended spectrum (4th Cs) Cefepime 553 β-lactamase 2be (ESBL: 213) New β-lactamase : 수십 종/년

35 Metallo-beta-lactamase의 출현
Carbepenem: 그람음성 간균에서 항균력이 가장 탁월함 Carbepenem의 내성 기전 1) beta-lactamase Serine beta-lactamase : Low Metallo-beta-lactamase: High 2) Outer membrane 의 불투과성 및 efflux 3) PBP 변화 사용할 항균제 제한 or ? MBL의 출현 Colistin: 제한적 항균제

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