유전공학 5장. DNA 정제.

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1 유전공학 5장. DNA 정제

2 DNA 분리 Animal cell : 세포벽이 없음. 계면활성제로 세포막 인지질 층 제거. SDS(이온 성 계면 활성제).
Triton X-100(비 이온 성 계면활성제). Plant cell : 물리적 방법 이용(얼렸다, 녹였다 반복함). Bacteria cell : Lysozyme, SDS, EDTA. 재조합 DNA 제조 시 필요한 DNA. Object DNA, Vector DNA(plasmid DNA, Virus DNA). *** Gene Cloning 시에 3종류의 DNA 필요함. Cloning할 DNA, 운반체 DNA(plasmid, virus). *** Buffer(TE buffer) : 활성을 갖는 DNA 분리 시 필수적.

3 세균에서 총 DNA 분리 1단계 : 배양된 세균 체 모음. 2단계 : 세균 체의 파괴.

4 세균에서 총 DNA 분리

5 세균배양을 위한 전형적인 배지조성

6 세균의 수집(Harvest) 대장균 : 37℃, 150 ~ 200 rpm/분, 16 ~ 18 hrs.
600㎚ 에서 OD =1.0 될 때까지 배양(대수기). Optical density(OD) 1.0 = 0.8 X 109 개/㎖.

7 세포 추출물(용균 액 : Bacterial lysate)
1.세포벽(Cell wall) 제거. 물리적 방법 : Sonicator 이용. 화학적 방법 : Lysozyme, EDTA, SDS. G(+) 세균 : Lysozyme(난황, 눈물, 침 속에 존재) 이용. 세포벽을 구성하는 Peptidogycan의 β-1.4-결합 끊어줌. G(-) 세균 : EDTA(Ethylene Diamine Tetracetate), SDS 이용. EDTA : 세포막 내의 Mg+2 제거함. SDS(Sodium Dodecyl Sulfate): 세포막의 지방성분을 제거하여 세포막 파괴. *** Bacterial lysate(세균 용균 액). 2. 세포 추출물의 획득 : 원심분리(Clear lysate).

8 세포 추출물의 준비

9 DNA purification(정제) Clear lysate로부터 DNA 정제. Pronase 처리.
Proteinase 처리. Phenol extraction(Phenol : Chloroform = 1 : 1). Rnase 처리. RNA, Protein 제거 작업.

10 DNA purification(정제)

11 DNA Concentration Na+(1가 이온)의 염류 존재 하에 ℃ Absolute ethanol(100% ethyl alcohol)을 2 Vol. 첨가한 후, 시간 정치. 원심분리 한 후 상층 액 제거하고, Air dry 시킨다(DNA 침전 : DNA ppt.). TE(Tris-EDTA) buffer로 DNA를 용해시킴. Ethanol Precipitation(EtOH ppt.).

12 DNA Concentration

13 DNA 농도 측정 및 정제 Buffer 내에 DNA 가 50 ㎍/㎖ 존재 시:
ds DNA : A260 = 1.0(흡광 감소 성). ss DNA : A260 = 1.37. Free base : A260 = 1.60(흡광 증가 성). A260/A280 = 1.8 이면, Purifying DNA. 1.8 이하 이면 불순물 존재 (Phenol, Protein, Ether 포함 시).

14 plasmid DNA 분리 크기에 따른 분리. 염색체 DNA를 깨지지 않게 함.
25% Sucrose 존재 하에 세포 용균 (세균 세포의 급격한 파괴를 방지함). Mesosome에 붙어 있는 염색체 DNA를 원심분리 하여 염색체 DNA를 제거한다.

15 plasmid DNA 분리

16 plasmid DNA 분리 형태에 따른 분리 방법. 1)Alkali 변성 법. 2)EtBr-CsCl 밀도 기울기 원심분리 법.
Super coil form. CCC- form. OC- form. L- form.

17 알칼리 변성 법

18 EtBr-CsCl 밀도기울기 원심분리 법 Ethidium bromide –Caesium chloride
Density gradient centrifugation.

19 EtBr(Ethydium bromide)의 구조와 기능
부력 밀도 감소 시킴 : g/㎤(L-form). CCC – form : g/cm3.

20 CsCl(Caesium Chloride)의 기능
Cs+ ion이 밀도 기울기를 형성함. 부력 밀도에 따라 DNA 밴드 형성함. DNA : 1.7 g/㎤. 단백질 : 낮은 부력 밀도로 상층에 위치. RNA : 바닥으로 침전됨.

21 CsCl(Caesium Chloride)의 기능

22 plasmid DNA 분리 및 정제

23 plasmid Amplification(증폭)
세균의 수가 최대치에 도달한 후, Chloramphenicol을 첨가. 12시간 배양 : plasmid DNA 만 복제됨 (plasmid DNA Amplification).

24 Bacteriophage 의 수집 PEG(Polyethylene Glycol) 이용.
1010 개/㎖ : 500 ng/㎖ 수확. Phage titre(역 가) : 파지 수/㎖.

25 ⋋ phage 역 가(Titre)를 유도하는 과정

26 ⋋ phage DNA의 정제 PEG 침전. TE buffer로 phage 용해. Phage 용균(Phenol 처리).
CsCl 밀도 기울기 원심분리. 1.45~1.5 g/㎤ band 형성. Dialysis(투석) : CsCl 제거.

27 ⋋ phage DNA의 정제

28 M13 DNA 분리 및 정제