SDS-PAGE analysis.

Presentation on theme: "SDS-PAGE analysis."— Presentation transcript:

1 SDS-PAGE analysis

2 SDS-PAGE란? (Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 단백질의 분자량을 결정할 때, 단백질의 혼합물을 분리할 때 사용 Discountinuous gel electrophoresis로 시행 ; 두 가지의 다른 gel이 붙어있는 상태 (Disc) SDS와 β-mercaptoethanol이 존재하는 조건에서 수행. β-mercaptoethanol : disulfate 결합(s-s bridge) 을 환원 SDS : 모든 단백질이 동일한 (-) 전하를 띄도록 만든 후 질량에 의한 polyacrylamide gel 상에서 이동속도 차를 이용하여 분리

3 Polyacrylamide Gel acrylamide, bis-acrylamide의 교차 결합에 의해 형성된 polymer.
종류 : SDS- polyacrylamide gel Native gel (단백질의 native한 size를 알 수 있다.) 특징 ① 기질이 단단하기 때문에 변성조건에서 단백질을 전기영동하기에 적합. ② polyacrylamide의 농도 ↑ : 분자량이 작은 단백질 분리에 적합. ③ polyacrylamide의 농도 ↓ : 분자량이 큰 단백질 분리에 적합.

4 SDS-Polyacrylamide gel?
stacking gel (0.5M Tris-Cl pH 6.8 ) polyacrylamide 농도 ↓ : pore size가 크다. ⇒ 단백질이 움직임의 제한을 받지 않고 빠르게 이동. 단백질 시료가 gel에 apply되었을 때 모든 시료가 같은 점에서 출발할 수 있도록 압축이 된다. separating gel (1.5M Tris-Cl pH 8.8) polyacrylamide 농도 ↑ : pore size가 작다. 단백질이 크기에 따라서 분리되기 시작. APS(Ammonium Persulfate) : acrylamide, bis-acrylamide의 중합반응을 일으켜 gel을 굳힌다. TEMED : 중합반응의 촉매역할. 염색 : coomassie brilliant blue (0.01㎍까지 검출가능)

5 PI(Isoelectric point)
: 아미노산과 단백질 등의 전하가 0이 될 때의 pH 값. ① pH값이 PI보다 낮은 상태일 때, 단백질은 (+) charge ② pH값이 PI와 같은 상태일 때, 전하는 0 ③ pH값이 PI보다 높은 상태일 때, 단백질은 (-) charge

6 SDS-PAGE Gel 만드는 법 SDS-PAGE kit을 조립. Separating gel 만들 때 들어가는
넣는다. Separation gel 위에 isopropanol을 넣어 Bubble을 제거하고 gel을 편평하게 해준다. (산화방지) Separating gel DDW

7 SDS-PAGE Gel 만드는 법 Comb DDW를 빼고 Stacking gel 만들 때 들어가는
Comb Stacking gel DDW를 빼고 Stacking gel 만들 때 들어가는 시료를 섞어 separating gel 위에 넣는다. (bubble 생기지 않도록 주의!) Comb을 꽂는다.

8 단백질의 분리과정

9 SDS-PAGE 실험 결과

10 1조 & 2조 – Tat-SOD (kDa) 72 48 35 30 19 Marker Marker Induction전
Purification 전 Purification 후 Purification 전 Purification 후

11 3조 & 4조 – PEP-1-Prx2 (kDa) 72 48 35 30 19 Marker Marker Induction전
Purification 전 Purification 후 Purification 전 Purification 후

12 5조 & 6조 – Tat-Atox (kDa) 72 48 35 30 19 17 5 Marker Marker Induction전
Purification 전 Purification 후 Purification 전 Purification 후

13 동물 실험 결과

14 1조 2조 3조 4조 5조 6조