NKM 교육자료.

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1 NKM 교육자료

2 NK세포(natural killer cell)
NK세포, NKcell이란? 혈액내에 있는 면역세포중의 하나이며, 생체방어기구에 있어서 중요한 역할을 하는 세포로써 항원의 인식 없이도 직접적인 암세포나 병원감염세포 등을 파괴하는 세포 NK세포의 기능 - 백혈병, 간암, 폐암 등의 많은 종양세포의 발생, 증식, 전이의 억제에 관여 바이러스 및 기생충, 진균, 세균 등 감염증의 억제 기능 - 정상인에 있어서 항 노화작용을 함 암세포 제거 방법 DNA를 절단시켜 “자살사”를 유도, 세포가 축소되고 DNA가 분절화되어 죽게 만듦 암세포에 구멍을 뚫어 “괴사”를 유도하여 세포가 팽창되어서 죽게 함

3 NK cell이 암을 제거하는 방법 DNA를 절단시켜 “자살사”를 유도하여 세포를 축소하여 핵산 DNA가 분절화되어 죽이는
방법이 있고, 암세포를 괴사시켜 “사고사”를 유도하여 세포가 팽창되어 구멍이 생겨 죽게 하는 방법이 있다. 암이라는 "미분화"된 세포에 대해서 "분화"된 Killer T (살인 T 세포)세포보다 미분화, 통합 세포인 NIE (Neuro신경-Immune면역-Endocrine내분비) Killer 세포 (NK세포)가 암세포를 죽이는 데는 더욱 더 필요하다는 것이다. 즉, 통합의료 (integrative medicine) 인 것이다.

4 NK cell의 암세포 작용기전

5 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 NK cell의 역할과 최근의 주목할 점 1. 매일 발생하지만 암세포를 제거한다.
- 암세포는 정상인이라도 하루에 1000~2000개씩 매일 발생한다. 그러나 이 암세포는 NK cell이 중심이 된 면역세포들에 의해 제거되어 암이 걸리지 않는 것이다. 2. 암의 재발, 전이를 막는다. - NK cell은 암세포의 발생을 감지할 뿐만 아니라, 수술 후 암의 재발 방지에도 효과적인 것으로 보고되고 있다. 3. T cell이 공격할 수 없는 암세포를 NK cell은 공격한다. - 암세포는 killer T cell (CTL)로 부터의 공격을 피하기 위해 암세포는 시간이 지날 수록 자기 자신의 항원을 바꿔 CTL로 부터의 공격을 피한다.(MHC class I 분자의 소실) 이러한 암세포는 항원의 인식 없이도 공격이 가능한 NK cell이 더 효과적으로 공격.

6 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 4. 항체가 결합해도 암세포를 공격할 수 있다.
- 암세포에 반응해 증식을 억제시키는 항체요법이 사용되는데 항체요법이 효과가 있는 이유중의 하나도 NK cell이 관여하기 때문입니다. 이것은 Y자형을 한 항체의 꼬리 부분에 NK cell이 결합해 활성화시켜 암세포를 죽이는 것이 실험적으로 확인 되고 있습니다. 요즘 항체요법과 NK cell 면역요법이 병용해 치료하는 예도 외국에서는 보고되고 있습니다.

7 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 5. 암에 대한 면역을 강하게 한다.
- NK cell은 암세포를 죽일뿐만 아니라, 수지상 세포를 자극시켜 CTL을 많이 만들어 내는 효과가 있고, 특히 기존의 수지상 세포의 몇십배나 높은 것으로 보고되고 있습니다. 어떻게 NK cell의 치료효과를 높일 수 있을까? NK cell은 취급하기 어렵지만 그 결점을 넘어서면 NK cell의 효과를 매우 높일 수 있다. 1. 대량의 NK cell을 사용한다. NK cell은 암이나 난치성 질환에 쓰일 수가 있기 때문에 실제로 임상에 쓰일려면 기존의 몇십배의 NK cell이 필요하게 된다. 그러나 늘리는 것이 쉽지는 않은 세포이다. 2005년에 발표된 가장 새로운 NK cell의 증식방법은 2개의 유전자를 재조합해 타인의 암세포와 혼합해 배양하는 방법인데 아직은 연구단계이다. 그래서 현실적으로 가장 안전한 NK cell의 배양이 지금 필요하다. 2.케모카인(Chemokines) 수용체 NK cell을 넣은 후 암세포로 가지 않으면 이 치료도 필요가 없는데 암세포가 만들어내 림프구를 모으는 역할을 하는 물질인 케모카인에 반응하는 항원을 NK cell이 내고 있는것이 중요합니다. NK cell은 케모카인 수용체의 하나인 CXC Receptor를 세포의 표면에 가지고 있습니다.

8 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 3. 암을 죽이는 TRAIL을 가지고 있다.
다양한 암세포의 표면에는 TRAIL Receptor 라고 하는 분자가 나옵니다. 이것은 정상 세포에는 없고 암세포만 나오기 때문에 면역세포의 좋은 표적이 됩니다. 이 TRAIL Receptor를 자극하면 암세포를 Necrosis 시키는 것으로 알려져 있습니다. 미리 항암제를 사용해 암세포를 조금 약하게 해두면 저항성이 약해져 암세포는 TRAIL로 부터의 자극으로 매우 죽기 쉬워집니다. 즉, 부작용이 적은 항암제를 사용하고 후에 면역세포요법을 시행하면 큰 효과를 기대할 수 있습니다. 미국에서 임상 진행 중

9 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 4. 약해진 NK cell 활성을 높인다.
NKM 요법이 필요한 이유 1. NK cell 은 T cell 과 혼합해 쓰는 것이 좋다. - 암세포는 림프구의 면역세포로부터 피할 수 있는 교묘한 방법을 얼마든지 가지고 있다. 면역 요법을 실시할 때 두 얼굴을 가진 암세포에 대항하기 위해 강한 활성을 가진 살상하는 방법이 다른 여러 가지 면역세포가 혼재하는 것이 좋은 것은 당연한 이치입니다. MHC class I 분자가 없는 암세포는 NK cell이 MHC class I 분자가 있는 암세포는 killer T cell이 효과가 있기 때문입니다. 2. 항암제와의 병용(TRAIL) - 통상 암치료에 여러 항암제를 조합해 쓰듯이 면역세포치료제도 항암제와 병용하는 것도 좋은 방법으로 생각됩니다. 항암제는 암세포의 증식을 억제하거나 면역세포가 암세포를 쉽게 죽일 수 있도록 해줍니다. 항암제로 암세포를 죽기 쉬운 상태로 한 후에 TRAIL로부터의 자극이 들어가면 암세포가 비약적으로 죽는 것이 논문으로 보고되고 있습니다.

10 NK cell을 이용한 면역 치료 요법 전이가 많이 이루어 졌거나 암세포의 크기가 비교적 클 때에는 항암제만으로도
힘들지만 면역 요법 만으로도 힘듭니다. 항암제와 병용함으로 암의 축소 효과를 높이거나 약해진 면역 기능을 보충하거나 수술 후의 전이나 재발 방지에 기대됩니다. 3. 가능한 대량으로 투여한다. 투여 림프구의 항암효과를 올리기 위해서는 CXC Receptor와 같은 암으로 유도하는 분자, 또 TRAIL등의 암세포를 공격할 수 있는 분자를 많이 세포 표면에 가진 NKM cell이 많게는 수십억 개에서 백억 개까지 필요합니다. 부작용: 약간의 미열이 있을 뿐 대량으로 들어가도 부작용은 아직 알려지지 않고 있다. 면역요법의 향후 과제는 투여되는 세포의 질보다는 생체 내에 투여한 세포의 활성을 확실하게 유지하면서, 더욱 세포를 종양에 집중시키는 세포 전달법( Cell Delivery System)의 개발에 달려있다고 생각됩니다.

11 면역세포요법의 개요 장 점 단 점 LAK 요법 배양공정이 간단하다 Killer세포로써의 치료 효과 기대
장 점 단 점 LAK 요법 배양공정이 간단하다 Killer세포로써의 치료 효과 기대 고전적 활성화 림프구요법 구성하는 세포가 다양해서 무엇이 유효한 세포인지는 불확실 살상 능력도 떨어짐 CAT 요법 Killer T 림프구를 단시간내에 대량으로 배양 가능 비교적 간단한 방법으로 많은 세포를 얻을 수 있음 Killer T 림프구로써의 공격 target을 지정할 수 없고 본래 환자가 가지고 있는 면역기억에 의지 수지상세포 백신요법 Killer T 림프구에 공격목표를 전달하는 기능을 이용, 특이적 암 면역요법으로 기대할 수 있음 이용가능한 암 항원정보가 적고 불확실하고 세포의 분화,유도도 현재까지는 아직 부정확하다 CTL 요법 현실적으로 암세포를 공격하는 killer T 림프구(CTL) 을 만드는 것이 가능하면 면역요법이 됨 100%의 CTL을 만드는 것은 현실적으로 불가능 암 항원에 대한 정보도 불충분 NK 세포요법 암에 대해 공격적인 성향을 가지고 있음 암과 직접 접촉하여 확실한 항종양 효과가 인정됨. NK cell을 대량으로 배양하는 것이 어려움. 특이적 면역은 아님

12 NKM(natural killer mix cell)
HPac AC Raji NK K-562 NK AC

13 NKM(natural killer mix cell)
1 Raji B cell lymphoma (s.c.) Balb/c nu/nu mice 10 days after single i.v. injection 1. PBS 2. PBMC 3. NK/NKT 2 3 3 3

14 NKM(natural killer mix cell)
effector cell과 target cell의 비율을 다양하게 하여 함께 섞어준후 6시간 후에 LDH로 반응시키고 Elisa를 통해 결과 분석 PBMC:AsPC-1 NK:AsPC-1 PBMC:Capan-2 NK:Capan-2 PBMC:K562 NK:K562 PBMC:U937 NK:U937 NK:ME180 PMBC:ME180 U937 : human lymphoma cell line ME180 : human cervical epidermoid cell line K562 : Leukemia cell line Capan-2 : human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line AsPC-1 : Pancreatic carcinoma cell line 결과: K562, U937, ME180세포에서 활성화된 자기 림프구세포가 효과적으로 암세포를 제거함을 보여주는 결과임.

15 배양 전 후 cytotoxicity 변화 NKM의 혈액암 세포주(K562)에 대한 cytotoxicity는 10 : 1 비율일 때 혈액의 면역세포보다 6 ~ 32 배의 증가를 보였습니다.

16 NKM(natural killer mix cell)
Table 1. Target cell lines used in this study. Cell lines Cell lineage Origin AGS epithelial Stomach cancer NCI-N87 MCF-7 Breast cancer MDA-MB-231 SK-HEP-1 Hepatoma HepG2 K562 myeloid Chronic myelogenous leukemia in blastic crisis

17 NKM(natural killer mix cell)
Cytotoxicity (%) Fig 4. Cytotoxicity of NKM and CAT cultured from lymphoma patients’ blood to various cancer cell lines. Data are means ± SEM of three independent experiments.

18 NKM(natural killer mix cell)
59.3  11.2 (n = 20) x expansion in total cell number with ~60% NK/NKT Population in 14 days

19 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 1. Measure cell distribution and purity of NKM-1 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : % After cultivation (NKM) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : %

20 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 2. Measure cell distribution and purity of NKM-2 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : % After cultivation (NKM) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : %

21 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 3. Measure cell distribution and purity of NKM-3 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : 6.08 % After cultivation (NKM) CD3 positive T cell : % CD16+CD56 positive NK cell : %

22 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 1. Measure cell distribution and purity of NKM-1 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD4 positive T cell : % CD8 positive NK cell : % After cultivation (NKM) CD4 positive T cell : 9.57 % CD8 positive NK cell : %

23 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 2. Measure cell distribution and purity of NKM-2 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD4 positive T cell : % CD8 positive NK cell : % After cultivation (NKM) CD4 positive T cell : 1.39 % CD8 positive NK cell : %

24 배양 전 후 세포 표현형의 변화 Fig 3. Measure cell distribution and purity of NKM-3 before and after cultivation for 14 days. Before cultivation (Whole Blood) CD4 positive T cell : % CD8 positive NK cell : % After cultivation (NKM) CD4 positive T cell : 6.51 % CD8 positive NK cell : %

25 NKM(natural killer mix cell)
채혈 및 혈액검사 1차 배양 2차 배양 (4일 후) 3차 배양 및 공정검사 (7일 후) 혈액검사: 간염, HIV, 림프구 세포수 검사 암종별 수치검사(별첨) 공정검사: 확인시험(현미경관찰법) 무균시험(직접법) 마이코플라즈마 부정시험(PCR법) 투여 (20~30억개) 완제품 검사 최종수집 (14일 후) 완제품검사: 확인시험(FACScan사용,성상) 무균시험(직접법) 마이코플라즈마부정시험(PCR,직접법) 엔도톡신시험(정량법) 세포활성도검사(Terra scan법, LDH유리법) 세포 생존율(Trypan blue dye염색법) 세포수 검사(혈구계수법)