Hematoxylin Hematoxylin의 산화제와 매염제

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1 Hematoxylin Hematoxylin의 산화제와 매염제
Hematoxylin 염료 자체는 조직과 친화성이 거의 없어 HgO (mercuric oxide), NaIO3(sodium iodate)과 같은 산화제를 첨가한 후 산화과정을 거쳐 자색의 hematein으로 전환시키는 숙성(ripening)과정을 거친다. 그러나 이 hematein도 조직성분과 강하게 결합할 수 있는 화학적 기능기가 없기 때문에 염료로서의 결합능을 획득하기 위해서는 매염제의 도움을 받아야 핵과 결합할 수 있다. Hematoxylin

2 Hematoxylin Hematoxylin의 산화제와 매염제
매염제가 첨가되면 hematein내의 OH 기와 금속이온 사이에 정전기적 결합이 일어나고, 다음 hematein 산소 원자가 금속이온과 배위결합(coordinate bond)하여 오각형의 고리(AI-O=C-C-O)가 형성되면서 안정한 구조인 hematein-mordant complex인 hematein lake가 형성 이 lake는 양(+)으로 하전되며, 조직성분 중 음 (-)의 성질을 띤 부위 (세포핵 등)와 이온결합하여 청자색 내지 청색으로 염색 Hematoxylin

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4 Hematoxylin Hematoxylin의 산화제 자연산화
빛이나 공기중에 노출시켜 자연적으로 산화시켜 숙성시키는 방법으로 숙성기간이 3~4개월이 걸리지만 일단 숙성되면 염색능의 보유시간이 길다 Ehelich와 Delafield hematoxylin Hematoxylin

5 Hematoxylin Hematoxylin의 산화제 화학적 산화
화학적 산화제를 사용하여 인위적으로 숙성시켜 사용하는 방법으로 산화가 신속히 진행되므로 염색능의 보유기간이 짧다. Sodium iodate, potassium permanganate, mercuric oxide, hydrogen peroxide, sodium perborate 등의 산화제와 혼합하면 매우 신속히 산화 hematein으로 1차 산화된 후에도 계속적인 산화반응을 하여 용액위에 금속성 침전물 막을 형성하므로 hematoxylin 용액은 사용전에 필히 여과 Hematoxylin

6 Hematoxylin 용액의 사용 여부 판별법 Before filtration After filtration
Hematoxylin solution

7 Hematoxylin Hematoxylin의 매염제
Hematein이 조직 구조에 대한 친화력이 약하기 때문에 매염제가 같이 사용 매염에 쓰이는 금속염은 ferric ammonium alum, ferric chloride, common alum(NH4, K salt), iron, phosphomolybdic acid, phosphtungstic acid, chromium, copper, aluminium 등의 물질(염)과 혼합하여 사용 조직검사실에서는 매염제로 aluminium과 iron을 주로 이용 Iron과 ferric salt는 산화제와 매염제의 기능을 갖고 있어 산화제를 첨가하지 않는다. Hematoxylin

8 Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin
Aluminium으로 매염된 hematoxylin 용액은 병리검사실에서 핵염색액으로 널리 이용되며, 조직표본에서 정상핵과 비정상핵을 잘 구별 Dye-mordant lake는 조직과 결합할 때 초기 정전기적 결합에서 공유결합으로 전환되어 결합력이 강해 alcohol 처리에도 저항성이 있다. 대부분의 alum hematoxylin 용액의 pH는 2.2~2.9 범위인데, 이는 핵산의 등전점이 pH 1.5~2.0 이므로 그 이상에 위치 Type of hematoxylin

9 Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin 종류
Harris hematoxylin 산화제 : Mercuric oxide 핵 염색이 명확히 나타나 검사실에서 가장 많이 사용 퇴행성 염색으로 사용 Mayer hematoxylin 산화제 : Sodium iodate 진행성 염색으로 사용되며, 특수 염색에서 핵을 대조 염색하는 경우 이용 Type of hematoxylin

10 Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin 종류
Delafield hematoxylin 마개를 하고 3~5일간 빛과 공기에 노출하여 자연숙성시켜 산화시킨 후 여과 Ehrlich hematoxylin 2주 이상 공기중에서 산화 Gill's hematoxylin (#1, #2, #3) 산화제 : Sodium iodate Carazzi's hematoxylin 산화제 : Potassium iodate Type of hematoxylin

11 Type of hematoxylin Aluminium mordanted hematoxylin alcohol의 기능
곰팡이(진균류)의 증식을 억제시키는 보존제 Glycerol의 기능 과산화를 막아주며, 용액의 증발을 방지 빙초산(glacial acetic acid)의 기능 핵염색의 선택성을 증진시키고 과산화작용을 완화하며, 산화제의 기능을 촉진하여 보다 좋은 염색성을 나타내도록 하는 염색 강화제 Type of hematoxylin

12 Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin Alum 다음으로 핵염색에 많이 쓰이는 매염제
Iron mordant hematoxylin 용액에 사용되는 철염(iron salt)은 산화제와 매염제의 두 작용을 공유 Ferric chloride와 ferric ammonium sulfate가 많이 사용되며, 매염제는 철염을 함유하고 있어 강한 산화능을 소유하고 있기 때문에 종종 hematoxylin 염색의 탈색액으로 이용 가장 주의해야 될 것은 산화로서, 항상 매염제와 hematoxylin 용액을 분리하여 두었다가 사용 전 즉시 혼합 (Weigert's hematoxylin)하여 염색하거나 따로 분리하여 사용(Heidenhain) Type of hematoxylin

13 Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin
일반 염색보다 특수염색의 핵염색에 사용되는데, 염색과정에 산성용액이 있는 경우 alum mordanted hematoxylin은 염색력이 약화되기 때문 종류 Weigert iron hematoxylin Ferric chloride를 매염제와 산화제로 동시에 사용 특수염색에서 더욱 좋은 결과를 나타낸다. Heidenhain's hematoxylin Ferric ammonium sulfate를 산화제와 매염제로 동시에 사용 Type of hematoxylin

14 Type of hematoxylin Iron mordant hematoxylin 종류 Verhoeff's hematoxylin
탄력섬유의 증명에 이용하며 Ferric chloride와 Lugol's iodine을 매염제와 산화제로 사용 Tungsten hematoxylin Tungsten (1% phosphotungstic acid)을 매염제로 사용하며, Mallory's PTAH염색에 사용 그 외 Loyez's, Molybdenum, Lead , Bohmer, Bullard hematoxylin 등 Type of hematoxylin

15 Type of hematoxylin

16 Routine staining 감별(differentiation)
Harris hematoxylin은 퇴행성 염색법에 사용하므로 핵을 과염색한 후 1% HCl-alcohol 용액으로 감별 alum hematoxylin은 pH가 2.95 정도이므로 acid alcohol 용액으로 분별하면 붉은색을 나타낸다. 감별이 완료된 조직은 수돗물이나 alkali 용액(약 pH8.0) 으로 처리 - blueing. 일반적으로 수돗물에서 충분히(10분 정도) 수세하는 방식이 좋으나 pH 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액 또는 pH 8.2 Scott’s tap water 등을 사용 Routine staining

17 Routine staining 핵의 청화액 (blueing:중화)
Alum은 용해되면 해리되어 aluminium과 수용액 내의 –OH기가 결합하여 불용성의 aluminium hydroxide을 형성 수용액 내에 많은 양의 산이 존재하면 aluminium hydroxide가 형성되지 않고 OH이온의 결핍으로 인해 alum hematoxylin도 불용성의 dye lake를 형성할 수 없게 되어 산용액 내의 alum hematoxylin은 적색으로 변화 청색화하기 위해서는 유리 산(free acid)을 중화시킬 수 있는 hydroxyl 기 (알칼리 용액)을 첨가 Routine staining

18 Routine staining 핵의 청화액 (blueing:중화)
물에 녹지 않는 안정된 청색의 불용성의 dye lake (aluminium-hematein-tissue lake) 가 형성 중화제 (청화액) 로는 40~50℃의 따듯한 물, 암모니아 수용액, lithium carbonate (탄산리튬)수용액이거나 0.5% potassium 또는 sodium bicarbonate, Scott's tap water substitute(가장 우수) 등의 알칼리 용액이 사용 Routine staining

19 Eosin Eosin 염색용액 (세포질 염색액)
Eosin 염색용액은 절편을 먼저 hematoxylin 용액으로 핵을 염색한 후 hematoxylin에 염색되지 않은 나머지 부분에 옅은 적색으로 염색 핵의 청색이 주위의 적색과 대조되어(contrast) 더욱 잘 보일 수 있도록 하기 위한 목적으로 시행하는 염색 세포질 염색액은 대개 산성 염료이며 조직구조의 염색은 eosin Y와 phloxine B가 주로 사용 사용되는 eosin Y의 농도는 0.5~2% 사이이며 RBC, muscle fiber, 세포질 등을 pinkish- red로 염색 Eosin

20 Eosin Eosin 염색용액 (세포질 염색액) Eosin 염료
Eosin은 산성 잔텐(acid xanthene), 프탈레인 (phtalein)계 염료로서, eosin Y, eosin B, phloxine, erythrosine의 네 종류가 있다. 브롬(Br)원자를 4개 갖고 있어서 tetrabromo-fluorescein이라 한다. alcohol 보다 물에 대한 용해도가 대단히 높다. Eosin은 hematoxylin과 같은 핵염색에 대한 대조로 적합하기 때문에 대조염색 중 가장 흔히 사용되는 염료 중 하나 Eosin

21 Eosin Eosin 염색용액 (세포질 염색액) Eosin의 염색 원리
단백질의 총 전하를 양(+)으로 변화시키기 위해서는 eosin 수용액의 pH를 6.0 이하로 낮춰야 하기 때문에 초산(acetic acid)를 소량 첨가하여 용액의 pH를 조절 Eosin의 pH는 약 4.6~5.0 사이에서 가장 좋은 염색성을 나타낸다. Eosin

22 Routine staining precedure
박절 후 paraffin ribbon을 60℃ oven에 1 시간 정도 건조시킨 다음 일반염색과정은 다음 단계를 거친다. 탈 paraffin 과정 조직내부에 침투된 paraffin과 조직 외부에 포매된 paraffin을 제거하는 과정 주로 xylene이 사용 박절표본은 뿌옇게 보이는 것은 완전히 건조되지 않아 물이 xylene에 혼합되었기 때문 함수과정 고농도의 alcohol로부터 저농도의 alcohol을 단계적으로 거친 다음 수세하는 것으로 이 과정의 목적은 염색용액이 대부분 수용액 상태이기 때문 Routine staining precedure

23 Routine staining precedure
염색과정 탈수 및 투명과정 염색 후 단계적인 탈수와 xylene으로 투명 Xylene 투명과정을 다 거치면 조직절편은 투명하게 보여야 하며, 만약 절편이 혼탁하게 보이는 것은 탈수가 불완전한 것 탈 paraffin에 사용했던 xylene은 용액 내에 paraffin을 함유하고 있기 때문에 봉입제의 경화작용을 방해하므로 탈수 후의 투명제로는 적합하지 않다. Routine staining precedure

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25 stain jar & rack

26 Autostainer

27 picric acid(2,4,6 –trinitrophenol) 2,4,6-trinitrobenzene
Dye vs Chromogen picric acid(2,4,6 –trinitrophenol) ,4,6-trinitrobenzene 염료(dye)와 색원체(chromogen)의 차이를 보여주는 그림이다. 두 화학적 구조의 차이는 무엇의 존재 여부에 따른 것인가? 1. 발색단 조색단 3. 벤젠 변색제

28 Hematoxylin(C16H14O6) Hematein(C16H12O6)
다음 중 다음 중 hematoxylin과 hematein에 대한 설명으로 틀린 것은? 1. hematoxylin은 옅은 갈색 색소이다 2. hematein은 hematoxylin의 산화물이다 3. hematein은 매염제와 결합해야 염기성염료로 작용한다 4. hematoxylin으로도 핵을 염색할 수 있다

29 HE 염색에 사용되는 자동염색기이다. 염색용기의 배열이 맞게 되어 있는 것은 ?
1. 탈파라핀 –함수-수세-핵염색-수세-세포질염색-탈수-투명-봉입 2. 탈파라핀 –탈수 –수세-핵염색-수세-세포질염색-함수-투명-봉입 3. 탈파라핀 –함수 –수세-세포질염색-수세-핵염색-탈수-투명-봉입 4. 탈파라핀 –함수 –수세-핵염색-수세-세포질염색-투명-탈수-봉입

30 HE염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다. 무엇 때문에 생긴 것인가 ?
1. 탈수 불충분 박절 결함 3. 기포 발생 자가융해

31 HE염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다. 무엇 때문에 생긴 것인가 ?
1. 헤마톡실린을 여과하지 않았을 때 2. 혈액이 많은 조직일 경우 3. 투명이 불충분할 때 4. 탈수가 불충분할 때

32 Section 1-12 Mounting 봉입

33 봉입의 개요 봉입은 염색이 완료된 조직표본에 봉입제를 묻힌 cover glass로 밀착시켜 씌우는 일이며, 조직표본제작을 완성하는 마지막 단계 염색표본을 명확히 관찰하기 위해서 slide와 굴절률이 유사한 점도가 높고 투명한 매질을 떨어뜨린 후 cover glass를 덮어 영구보존 해야 하는데 이때 사용하는 매질을 봉입제(mounting medium)라 한다. Mounting

34 Mounting 봉입의 의의와 기능 염색표본의 물리적 손상, 산화에 의한 퇴색의 방지하여 염색성에 변화를 주지 않고,
염색의 퇴색과 조직절편의 부패를 방지하며, 표본을 오래 투명하게 유지할 목적으로 사용되어지고 있다. Mounting

35 Mounting 준비 기구 및 재료 봉입용 forcep 여과지(filter paper) Gauze 봉입제, balsam병
Slide 정돈판 (mappe) Slide lable sticker (slide 부착용) Cover glass 증기 흡입기, Hume hood나 clean bench Mounting

36 봉입제가 갖춰야 할 조건 봉입제의 굴절률(refractive index)이 조직의 평균 굴절률인 1.530~1.540에 가까워야 하고 slide 위에 부착한 조직절편과 cover glass 사이에 고르게 펴져야 하며 비교적 짧은 시간에 굳어져야 하고 무색 투명해야 하며 접착력이 있어야 한다. 기포가 잘 빠져야 한다. 염색 결과에 영향을 주어서는 안되므로 pH가 중성이 되어야 한다. Mounting

37 Mounting 수용성 봉입제 지방염색 지방은 alcohol에 용해되므로 탈수과정 없이 봉입
amyloid(유전분체)의 이염색성 염색, 변색성 염색 alcohol이나 xylene 등에 의해 퇴색되며, 변색성 염색을 한 후 비수용성 봉입제로 봉입하면 염색성이 정색성으로 변화하기 때문 면역형광법을 이용하는 검사 조직 내의 효소 검출 시 Mounting

38 Mounting 수용성 봉입제 수용성 봉입제의 종류 Glycerol(glycerin)
Mineral oil(liquid paraffin) Glycerin jelly(glycerol gelatin) 봉입 후 단단히 굳힌 후에 coverslip의 가장자리를 메뉴큐어로 잘 밀봉하여 두면 몇 년간 염색 표본의 보존이 가능 Apathy gum syrup Levulose(fructose) syrup Mounting

39 Mounting 비수용성 봉입제 최초로 사용된 봉입제는 천연에서 생산되는 Canada balsam
천연수지를 가공하지 않은 상태로 사용하면 봉입이 더디고 cover glass가 단단히 굳기까지 시간이 오래 걸리며, 염색된 조직이 점점 퇴색되는 등의 단점이 있다. 수지를 원료로 하는 봉입제는 항상 xylene 등과 같은 용매로 적당한 점도를 유지시켜 사용해야 되므로 염색된 절편을 완전히 탈수하지 않으면 잘 혼합되지 않아 혼탁을 일으켜 검경을 방해 Mounting

40 Mounting 비수용성 봉입제 천연수지 봉입제 천연수지는 완전히 굳는데 2~3개월 걸리며, 오래되면 황색으로 변하고,
용매가 증발하고 나면 균열이 발생 장기간 보관할 경우 천연수지에 포함되어 있는 산성성분이 염색 색조를 퇴색시키는 단점 종류 Canada balsam (굴절률 1.541~1.547) Gum dammer Mounting

41 Mounting 비수용성 봉입제 합성수지(synthetic resin) 봉입제
주로 β-pinene polymer로 이루어졌다. 장점 화학조성을 알 수 있으며 안정되고 순수하다. 휘발성 유기용매에 쉽게 용해된다. 색상이 투명하며, 오랜 시간이 지나도 황색변화가 발생하지 않는다. 1 시간 이내에 건조 조직절편과 슬라이드의 굴절율이 동일한 굴절율을 갖는다. (Rf=1.53~1.54) Mounting

42 Mounting 비수용성 봉입제 합성수지 봉입제의 종류 Eukitt : 굴절률 1.510
Harleco synthetic resin : 굴절률 1.548 Permount : 굴절률 1.529 Bioloid : 굴절률 1.550 Histoclad : 굴절률 1.560 Caedax Mounting

43 봉입의 방법 봉입제의 양이 적으면 기포가 생기기 쉽고, 후에 봉입제가 건조되면서 공기가 들어가면 표본의 질이 떨어진다. 봉입제의 양이 너무 많으면 봉입제가 cover glass 밖으로 새어 나와 slide가 지저분하게 되고 현미경 검경 시 뿌옇게 보이므로 이때는 여과지에 slide를 세워 여액을 흘려 보내고 xylene을 묻힌 gauze로 가장자리를 닦아낸다. 조직표본에 xylene이 말랐을 경우 xylene에 담궈 두었다가 다시 봉입한다. Mounting

44 봉입의 방법 작은 기포들이 생겼을 때는 예리한 forcep으로 가만히 눌러 빼낸다. Forcep으로 눌러도 잘 빠지지 않는 것은 xylene 용액에 담그어 두었다가 cover glass를 떼어내고 다시 봉입한다. 지방 염색 후 수용성 봉입제로 봉입할 때는 기포가 생겼다고 forcep으로 눌러주면 지방방울의 위치가 변할 수 있으므로 눌러서는 안된다. Mounting

45 봉입의 방법 Mounting

46 봉입의 방법 Mounting

47 Automatic coverslipping machine

48 염색 후 봉입하는 과정이다. 지방 염색을 하였다면 다음 중 어떤 봉입제가 적당한가?
1. Canada balsam Glycerin jelly 3. Permount Caedax

49 Hematoxylin Hematein-lake Harris hematoxylin용액이다. 왼쪽은 알코올에 헤마톡실린만을 녹인 것이고 오른쪽은 매염제와 산화제를 넣어 만든 완성 용액이다. 사용된 산화제는? 1. Pot. Permanganate Hydrogen peroxide 3. Sodium iodate Mercuric oxide