RNA analysis.

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1 RNA analysis

2 RNA isolation from liver tissue
특정 조직 또는 세포를 용해시킨 후 RNA를 추출해 본다. Total RNA가 깨끗하게 분리 되었는지 확인하기 위하여 agarose gel에 전기영동하여 결과물을 확인한다. 이후에 유전자 발현을 측정하기 위해서는 추출한 RNA를 cDNA로 합성 한 후 quantitative-PCR을 수행하여 발현을 확인한다. Total RNA 중 mRNA는 약 1%에 해당되고, 관심 있는 특정 mRNA는 그 중에서도 극히 일부이다. 그러므로 이 mRNA를 증폭해서 눈으로 확인하기 위해 RT-PCR을 수행한다.

3 RNA isolation cDNA synthesis (RT-PCR) Quantitative PCR (qRT-PCR)

4 Introduction RNA analysis
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 유전자 발현을 보고자 할 때, DNA는 exon과 intron이 있으므로 이를 template로 쓰지 않고, mRNA를 template로 사용하여 exon만 증폭시킨다. mRNA를 이용하면 각 조직마다의 expression 정도를 보는 데에 용이하다. PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 하는 경우에는 일단 DNA로 복사한 다음 증폭한다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR이라고 한다. 이 때에는 RNA로부터 DNA로 합성해 주는 효소인 reverse transcriptase를 처리한다.

5 Introduction RNA analysis
Quantitative RT-PCR Real time PCR에는 특정 파장의 빛 에너지를 흡수하였다가 고유 파장으로 빛을 발산하는 형광 물질을 사용한다. (Fluorescents Dye) Intercalator type : SYBR green, Eva Green 등 Probe type Hydrolysis probe : TaqMan 등

6 Materials & Methods RNA isolation
RNA sample, 1% agarose gel, gel documentation, cDNA synthesis kit, PCR machine, primers, PCR pre-mix, pipet, tip Gel electrophoresis 1% agarose gel을 만든다. 추출한 total RNA를 5ul씩 loading 하여 전기영동한다. Gel documentation을 이용하여 밴드를 확인한다. 28S 18S

7 RNase free-water (DEPC-water)
Materials & Methods RNA isolation cDNA synthesis 측정한 RNA의 농도가 1ug이 되도록 계산한다. PCR tube에 들어있는 2X RT pre-mix에 RNA, 50uM Oligo(dT) , RNase free water를 넣어 pipetting 한다. (bubble이 일어나지 않도록 주의) 상온에서 5분간 incubation 한다. PCR 기계에 넣고 cDNA synthesis reaction을 수행한다. : 50 ℃, 60min (cDNA synthesis) / 95 ℃, 5min (RTase inactivation) Contents Volume RNA 1ug of total RNA ? ul Primer 50uM Oligo(dT) 1ul 2X RT Pre-mix 10ul RNase free-water (DEPC-water) (20-?) ul Total volume 20ul

8 Materials & Methods RNA isolation Quantitative RT-PCR Contents Volume
2X SYBR green 12.5 ul Primer-forward 0.25 ul Primer-reverse ddw 2 ul cDNA (10ng) 10 ul total 25 ul

9 Results REPORT Gel 전기영동하여 나온 밴드 사진 첨부하세요.
RNA isolation REPORT Gel 전기영동하여 나온 밴드 사진 첨부하세요. Kit를 사용하지 않고 매뉴얼로 RNA prep 진행과정을 조사하여 작성하세요. RNA isolation-RNA analysis의 전체과정을 작성하세요.