4-α-Glucanotransferase에 의해 백설기의 변형된 전분에 대한 구조적 특성

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1 4-α-Glucanotransferase에 의해 백설기의 변형된 전분에 대한 구조적 특성
2010 식품 가공학 특론 Insert Document Summary here 4-α-Glucanotransferase에 의해 백설기의 변형된 전분에 대한 구조적 특성 충북대학교 식품공학과 한덕만

2 목차 선정 논문과 선정 이유 효소 특성 연구 목적 실험 방법 결과 결론

3 선정 논문

4 선정 이유 식품산업에서 떡은 제대로 가공식품으로 나오지 않아 그것에 관해 궁금하고 해결방안을 생각해 보기 위해 이 논문을 선택
식품산업에서 떡은 제대로 가공식품으로 나오지 않아 그것에 관해 궁금하고 해결방안을 생각해 보기 위해 이 논문을 선택 떡는 산업적으로 생산하는데 어려움이 있음 이유 : 높은 전분 노화율로 인해 유통기한이 매우 짧아짐. 저장성이 떨어짐 전분의 노화과정을 늦추기 위한 많은 연구가 시도됨 이러한 연구를 통해 전분의 노화를 지연시키기 위해서 그리고 품질 향상을 위해 유화과정, 올리고당 생성, 다당체 생성에 관여하는 많은 효소들이 개발됨 (Kweon and others 1994; Christophersen and others 1998; Lee and others 2002; Gujral and others 2003) 전분 연구에 이용된 효소는 직접적으로 전분 구조를 변형시킴으로써, 전분의 노화를 방지시키며 유동적 특성(물질의 특성을 변화시킴)을 향상시킴 다양한 효소를 이용하여 변형된 전분의 기능성 특성은 식품산업에서 커다란 주목을 받고 있음

5 4-α-glucanotransferase
식물의 불균화 반응(당을 움직여 구조를 변경-가수분해 또는 재결합 반응을 일으킴)에 이용되는 효소 Glucose의 α-1,4 결합을 가수분해하거나 malto-oligosaccharide의 donor(당을 내줌) 분자가 새로운 α-1,4 결합을 통해 acceptor(당을 받음)에 결합(tranfer함)하는 반응을 함 TSαGTase는 Thermus scotoductus 에서 유래함 TSαGTase를 감자 전분에 반응하면 크기가 작은 올리고당의 생성은 없으며 amylopectin의 side chain(가지)의 재결합이 상당히 많이 이루어짐 (Park and others 2007) 즉, amylose가 amylopectin의 짧은 side chain쪽으로 결합하여 amylose의 함량이 낮아지게 만드는 효소임

6 상동성 비교 Thermus scotoductus Thermus aquaticus Thermus brockianus
Meiothermus silvanus Deinococcus geothermalis

7 4-α-glucanotransferase의 구조
PDB ID : 1LWH (dimer) Thermotoga maritima Anna Roujeinikova et al., J. Mol. Biol. (2002) 321, 149–162

8 연구 목적 TSαGTase 처리를 통해 백설기에서 쌀 전분의 구조와 질감(texture), 노화율에 미치는 영향을 알아보고자 함 이를 통해 백설기의 유통 및 저장 기한을 연장시키는 연구를 하고자 함 이번 연구는 식품계(식품의 반응계)에서 품질과 저장 기한의 향상을 위해 4-α-glucanotransferase를 이용한 선도적인 시도임

9 Materials and Methods

10 TSαGTase의 cloning과 효소 정제
Thermus scotoductus strain (ATCC 27978) : American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입 유전자를 cloning하고 형질 전환함(Park and others 2007) E. coli MC1061을 host로 이용 사용 plasmid는 pGNX4와 pUC119를 cloning에 이용 TSαGTase의 정제는 Ni-NTA affinity chromatography를 이용 재조합 대장균 1L 를 배양 4℃ 원심분리에서 10000xg, 10분간 원심 분리하여 세포만 획득 Cell pellet은 100ml lysis buffer에 다시 풀어줌

11 TSαGTase의 cloning과 효소 정제
Sonicator를 이용하여 얼음에서 셀을 파쇄 Crude한 세포 추출액을 다시 원심분리(4℃, 10000xg, 20분) 2ml의 Ni-NTA resin이 packing된 column에서 세포 추출액 2ml을 loading Washing buffer로 column을 resin과 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 wash함 Elution buffer를 이용하여 TSαGTase를 elution함 Elution 한 효소는 SDS-PAGE로 정제 확인 최적 buffer인 50mM Tris-HCl (pH 7.5)로 투석 최적 반응 조건 : 75℃, pH 7.5로 반응

12 TSαGTase의 활성 측정 TSαGTase의 활성은 amylose가 전환되는 것을 요오드 용액에 반응하여 측정 (Liebl and others 1992) 반응 조건 : 기질인 0.2%의 amylose 250ul와 1%의 maltose 50ul에 최적 buffer 600ul을 섞고, 효소 100ul을 넣은 후 70℃에서 10분간 반응 Total reaction volume 1ml =0.2% amylase 250ul+1% maltose 50ul+buffer 600ul+enzyme 100ul 10분간 끓여줌으로써 반응 정지 1ml의 요오드 용액을 넣은 후, spectrophotometer를 이용해 620nm에서 흡광도를 측정 TSαGTase unit의 정의 : 분당 amylose가 0.5mg/ml로 가수분해되는 효소의 양 단백질 농도는 Bradford방법을 이용, stanadard는 BSA(bovine serum albumin) 사용

13 백설기 제조 후 쌀 전분 분리 쌀가루는 삼립 식품에서 얻음
각각의 재료(쌀가루 100 g, 설탕 10g, 소금 1g, 물 20ml)를 섞음 재료에 TSαGTase를 넣고 75℃에서 3시간 방치 효소가 들어간 재료는 플라스틱 틀에 넣고 30분간 찜 30분간 찐 후, 30분간 식힘 효소가 없는 백설기도 같은 방법으로 제조하고 이것을 control로 함 백설기 1g을 90%의 dimethyl sulfoxide에 1%가 되도록 넣어줌 1시간 가열 후, 약 16시간(overnight) 동안 교반(stirring) Sample의 6배 volume의 ethanol을 넣어 다음 잘 섞어줌 원심분리 후, 상등액을 제거 후, 침전물은 50℃에서 건조시킴 (분말로 만듦)

14 Amylose 함량 분석 백설기 속에 있는 쌀 전분의 amylose함량은 요오드 측정법을 이용하여 색의 변화를 측정(juliano 1971) Sample 100mg을 정확히 취한 후, 50ml의 삼각 플라스크에 넣음 95% ethanol 1ml과 1N NaOH를 9ml을 넣어줌 끓는 물에 10분간 가열함 실온에서 식힌 후, 100ml의 메스 플라스크에 옮김 이 플라스크에 전체 volume이 100ml이 되도록 증류수를 첨가함 전분 용액 5ml(위에서 만든 전분 용액)을 새로운 100ml의 메스 플라스크에 넣고, 1N의 acetic acid 1ml과 요오드 용액(요오드 0.2g과 potassium iodide 2.0g을 넣어 액상의 용액으로 만듦) 2ml을 첨가 100ml의 부피가 되도록 증류수를 채워 희석한 다음, 섞어주고 20분간 방치 Spectrophotometer를 이용해 620nm에서 흡광도 측정

15 쌀 전분의 분자량 측정 방법 백설기 속의 쌀 전분의 분자량은 SEC-MALLS-RI system(레이저 빛이 샘플에 쪼여 준 후, 산란되어 생기는 다양한 각을 측정하여 size를 확인)을 이용해 분석함 SUGAR KS-804와 KS-806 column 두 개를 일렬로 연결한 후 실온에서 측정 이동상(0.02%의 NaN3가 들어 있는0.15M NaNO3용액)은 0.4ml/min의 유속으로 흘려줌 건조시켜 분말이 된 sample은 이동상과 같은 용액에 녹인 후, 가압멸균(autoclave; 121℃, 20min)함 가압 멸균된 sample을 주사기용 filter(pore size 5-um)로 여과 후 SEC-MALLS-RI system에 주입 Sample의 평균 분자량은 ASTRA V (software 이름) program으로 계산

16 HPAEC(Bio-LC) 분석 효소처리된 전분의 side chain의 분포를 알아보기 위해 isoamylase를 이용해 가지를 분해 시킨 후 분리함 Isoamylase의 반응 조건 : 60℃에서 60시간 반응, 25mM NAOAC buffer(sodium acetate buffer, pH 4.3) 5분간 끓여 줘 반응을 정지하고 amylopectin 가지의 다양한 결합길이는 Bio-LC를 이용해 분석 Bio-LC에 사용한 column은 CarboPac PA-1 column이고 이 column을 통과하여 각각의 가지로 결합된 길이가 다양한 올리고당이 분리됨 백설기 속에 있는 malto-oligosaccharide의 구성 분석은 백설기 1g에 100ml의 증류수를 넣고 1시간 가열 주사기용 filter(pore size 5-um)로 여과 후, isoamylase 처리를 하지 않고 다른 조건은 동일하게 한 다음 Bio-LC로 분석

17 Differential scanning calorimetry(열량 측정기)
백설기 sample을 4℃에서 24시간 방치 후 전분 노화의 정도를 실험 백설기 sample의 노화는 differential scanning calorimetry(DSC)를 이용해 측정 DSC는 indium(156.6℃, J/g)과 tin(232.2℃, 60.62J/g)을 이용해 0점 조절을 하고 reference로 증류수를 사용 물과 고형물인 백설기가 수분 함량이 1:1 되도록 만든 다음, 10mg으로 무게를 잰 백설기 sample은 알루미늄 팬에 밀봉하여 넣고 5℃/min씩 증가하는 속도로 20℃에서 120℃까지 가열 노화 정도는 DSC 분석으로 나타난 40℃에서 80℃사이의 흡열 peak의 면적을 계산한 엔탈피로 표현함

18 백설기의 질감(texture) 분석 Texture profile analysis (TPA)는 texture 분석기를 이용해 실온에서 백설기 sample 6g을 측정 2-cycle compression은 시간당 가해지는 힘을 비교하는 것으로 지름 50mm로 된 원형의 플런저(피스톤 같은 것을 밀어내도록 되어 있는 기기)로써 texture 분석은 이 플런저를 가지고 50%의 압력을 가해 2mm/s의 속도로 실험 TPA의 수치값은 Munoz(1986)에 의해 정의 내려지고, Bourne(1982)가 기술함

19 Results and Discussion

20 백설기 속의 amylose와 malto-oligosaccharide함량 분석결과
표1에서 보면, TSαGTase 처리는 16.6%에서 12.7%로 백설기 속의 amylose의 함량을 낮춤 낮은 amylase 함량을 갖고 있는 백설기는 texture가 좋아지고 노화가 늦어짐 전분의 노화는 효소처리에 의해 amylose 결합이 효소반응 중 일어나는 재결합 반응에 영향을 받아 amylose 함량이 낮아지고 이러한 전분은 저온에서 저장하는 동안 전분의 노화가 천천히 진행된다고 보고됨 (Auh and others 2006) 효소 처리된 백설기의 malto-oligosaccharide의 함량은 control과 비교했을 때 함량이 더 높음

21 백설기 속의 TSαGTase 처리한 쌀 전분의 분자량 분석

22 백설기 속의 쌀 전분의 가지 결합의 분포

23 백설기 속의 쌀 전분의 가지 결합의 분포

24 백설기의 질감 분석 TSαGTase처리한 백설기의 hardness(견고성)은 4℃에서 24시간 방치한 후, 측정해 보니 control과 비교했을 때 약간 증가함 (control의 증가 폭이 더 큼) cohesiveness(응집력)의 control과 TSαGTase처리한 sample과 유사한 결과가 나타남 Adhesiveness(접착성)의 변화는 확실히 차이가 있음 control은 거의 접착성이 사라진 반면에 효소 처리한 sample은 유지가 됨 이러한 결론을 종합해 보면, 전분의 노화 정도는 효소에 의한 구조 변형으로 확실히 감소 시킴을 알 수 있음

25 백설기의 노화

26 백설기의 노화 저장기간 동안 control의 백설기가 TSαGTase처리한 백설기보다 노화율이 더 높음
4℃에서 24시간 저장한 후, 효소 처리한 sample은 control (1.4mJ/mg)보다 더 낮은 값(0.4mJ/mg)을 나타냄 TSαGTase의 처리가 백설기에서 전분의 노화를 효과적으로 저해함을 보여줌 전분을 가수분해하는 효소가 전분의 노화를 늦추는 것은 필수적인 mechanism이지만 아직 완전히 밝혀지지 않음 종종 이러한 효소가 amylopectin 분자의 구조를 변형시키는 것은 저장기간 동안 분자구조가 단단해지는 현상이 증가되지 않도록 분자가 재결합하기 때문인 것이 확실하다는 보고가 있음(Gerrard 1997; Gujral and others 2003; Hug-Iten and others 2003)

27 Conclusion

28 저자의 결론 이번 연구로 TSαGTase의 처리로 인해 Amylose의 함량이 감소되는 것과 Amylopectin이 재결합하는 것, malto-oligosaccharide가 형성되는 것이 백설기에서 전분의 노화를 지연시키는 효과가 있음을 기정 사실화 함 TSαGTase 처리는 백설기 속 쌀 전분의 노화를 저해시키는 amylose 함량의 변화와 전분 분자량의 감소, amylopectin의 가지의 결합 길이의 변화를 발생시킴 결과적으로 분명한 것은 TSαGTase와 같은 효소를 쌀 전분에 처리하는 것이 백설기의 산업적 생산에 성공적으로 적용할 수 있음을 확인 본 연구의 실험적 증거가 malto-oligosaccharide, amylose, amylopectin과 같은 각각의 탄수화물의 구성 분이 어떻게 노화를 지연시키데 효과가 있는지 확인하는 것에는 부족함 전분의 노화는 쌀 전분의 산업적 이용에 가장 주된 문제가 되기 때문에, 백설기의 산업적 생산공정의 향상을 위해서는 쌀 전분 노화 방지에 대한 분자 수준의 메커니즘의 이해와 연구가 필요함

29 발표자의 결론 전분 구조 변화가 전분의 물리화학적 특성에 영향을 미치며, 산업적인 이용에서 중요한 요소로 작용할 수 있다고 생각됨 이러한 효소 공정에 의한 가공은 선택적이고 예상 가능한 산물이 나오기 때문에 물리 화학적 공정 중 나타날 수 있는 예상치 못한 결과물에 대한 단점을 극복할 수 있음 Thermus scotoductus 에서 유래한 4-α-glucanotransferase를 식품 산업에 적용할 수 있는지 제시되지 않았음 만약 유전자 변형 효소를 식품에 적용이 불가능 한다고 해도 우선적으로는 이러한 효소 공정을 개발한 후, GRAS 미생물에서 유래한 효소를 이용하면 될 것으로 생각됨 요즘은 다국적기업에서 유전자변형 효소의 사용 승인을 얻어 이용하고 있으므로 필요하다면 (경제적 부담이 크지만) 승인을 얻으면 될 것으로 판단됨

30 참고문헌 Kwang Yeon Lee et al. (2008). Rheological and gelation properties of rice starch modified with 4-α-glucanotransferase. International Journal of Biological Macromolecules. 42, 298–304. N.-S. SEO et al. (2007). Structural Characterization of Rice Starch in Rice Cake Modified by Thermus scotoductus 4-α-Glucanotransferase (TSαGTase) JOURNAL OF FOOD SCIENCE. Vol. 72, CHANG-KYU LEE et al. (2008). Enzymatic Synthesis and Properties of Highly Branched Rice Starch Amylose and Amylopectin Cluster. J. Agric. Food Chem. 56, 126–131 Anna Roujeinikova et al. (2002). Crystal Structure of Thermotoga maritima 4-a-Glucanotransferase and its Acarbose Complex: Implications for Substrate pecificity and Catalysis J. Mol. Biol. 321, 149–162