항균제 감수성 검사 (antimicrobial susceptibility test)

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1 항균제 감수성 검사 (antimicrobial susceptibility test)
13조 124번 황병언

2 항균제 감수성 검사 감염 원인균에 대한 치료 효과가 높은 항균제를 선택하는데 도움
병인균과 항균제 감수성 양상을 예측하지 못하는 균종, 내성이 문제가 되는 균종에 대하여 시험함이 원칙

3 해석 기준 최소억제농도를 기초로 한다. 최소억제농도 (MIC, minimal inhibitory concentration)
: 배양된 세균의 육안적 증식을 억제할 수 있는 항균제의 가장 낮은 농도 임계점(breakpoint) : 혈중내에 도달할 수 있는 항균제 농도로서 이 농도에서 균 증식이 억제되지 않으면 감수성이 없음을 의미한다.

4 검사 종류 균종에 따라 달라지며 호기성 세균만을 대상으로 한다면 1. NCCLS의 디스크 확산법
2. 상품화된 microdilution 법 3. Epsilometer test (E test)

5 1. 디스크 확산법

6 배지 대부분 Mueller-Hinton agar (MHA)를 사용한다. 1. 재현성이 좋다.
2. sulfonamide, trimethoprim, tetracycline에 대한 억제 성분이 거의 없다. 3. 대부분의 병원균이 잘 자란다. 4. 현재까지 MHA를 사용하여 얻은 자료가 많이 축적되었다.

7 균접종액 증식법 평판배지에 분리된 동일한 형태의 집락 3-5개 이상을 4-5 mL의 액체 배지(tryptic soy broth)에 풀은 후 35℃에서 2-6시간 배양하여 McFarland 0.5 탁도로 맞춘다. 직접법 혈액한천배지와 같은 비선택배지에서 18-24시간 증식된 집락을 액체배지 또는 생리식염수에 직접 풀어 McFarland 0.5 탁도로 맞춘다.

8 시험 방법 장내세균, 포도당비발효 그람음성간균, 장구균과 Vibrio cholerae :증식법 또는 직접법으로 균접종량 맞춤
포도구균, Haemophilus, N. gonorrhoeae, S. pneumoniae, β-용혈성 연쇄구균 :직접법으로 균접종량을 맞춤 균접종량을 맞춘 후 15분이내에 면봉으로 균액을 묻힌 다음 균액이 없는 시험관 벽에 대고 돌려서 짜낸다. 충분히 마른 MHA 배지 표면에 균액을 묻힌 면봉을 골고루 획선한다. 획선 방향을 60°씩 회전하여 2번이상 골고루 획선한다. 배지 뚜껑을 3-5분 동안 일부를 열어 놓아 습기가 흡수되도록 하되 15분이상 말리면 안된다.

9 시험 방법 항균제 디스크를 멸균된 핀셋이나 dispenser를 이용하여 배지표면에 붙인다.
디스크를 붙인 후 15분이내에 배지가 위가 되게 하여 35℃ 배양기에 넣는다. 균종별 배양방법에 따라 배양한 후 억제대의 지름을 측정한다. (억제대 지름은 자, caliper 또는 template (해석기준의 동심원 본)을 이용하여 육안으로 mm 단위로 잰다)

10 판정 해석기준 :항균제의 보통 용량을 투여했을 때의 혈중 농도를 기준
예외> 요로감염에만 쓰이는 nalidixic acid : 요중 농도를 기준 감수성(Susceptible) 일반적으로 그 균종의 감염에 추천되는 항균제를 보통 용량  투여했을 때 치료될 수 있을 것임을 뜻함 중간(Intermediate) 기술적인 오차발생으로 인하여 결과를 잘못 판단하는 일이 없도록 완충구역을 만든 것 내성(Resistant) 일반적으로 그 균종 감염에 권장되는 항균제를 보통 용량을 투여해서는 치료되지 않을 것임을 뜻함

11 해석 Clusster group 감수성 시험 결과나 임상 효능이 비슷하기 때문에 중복으로 시험할 필요가 없는 항균제
모든 항균제에 대한 감수성검사를 시행할 수가 없다. class drug (class disk, 대표항균제)으로 정하여 그 결과를 동일 계열의 다른 항균제에도 적용 Clusster group 감수성 시험 결과나 임상 효능이 비슷하기 때문에 중복으로 시험할 필요가 없는 항균제 Related gruoup 항균력 범위와 감수성 시험 결과가 거의 같고, 거의 완전한 교차내성 및 감수성이 있다 균종에 따라 자연내성인 항균제는 보고하지 않는 것이 바람직

12 Report group Group A: 특정 세균에서 통상적인 감수성 시험 및 결과의 보고가 필요한 항균제
Group B: 임상적으로 중요하며, 통상적인 감수성 시험이 필요한 항균제. 그러나 결과는 선택적으로 보고 Group C: 대체 또는 보조적인 항균제

13 Enterobacteriaceae - imipenem or Tetracyclines tetracycline(C)
Fluoroqunolones ciprofloxacin(B) Folate pathway inhibitors trimeth-sulfa(B) Phenicols Chloram- phenicol(C) Penicillins ampicillin(A) -lactam/inhibitor amx-cla or amp-sulb(B) Cephems cefazolin or cephalothin(A) cefamandole(B) cefoxitin or cefotetan(B) cefotaxime(B) ceftazidime(C) cefepime(B) Carbapenems - imipenem or meropenem(B) Monobactams aztreonam(C) Aminoglycosides gentemicin(A) amikacin(B) tobramycin, netilmicin(C)

14 균종별 해석 방법 장내세균 Cefazolin, cefuroxime, cefpodoxime, cefproxil과 laracarbef : cephalothin에 내성인 장내세균의 일부 균주에 감수성일 수 있으므로 이들 약제에 대해 시험할 수 있다. Salmonella 균주와 Shigella 균종이 대변에서 분리될 때 : ampicillin, quinolone, trimethoprim/sulfamethoxazole 장외감염에서 분리된 균주일때 : chloramphenicol과 3세대 cephalosporin을 추가로 시험 1세대와 2세대 cephalosporin, aminoglycoside에 대하여 항균제검사는 감수성이어도 임상적으로 효과가 없으므로 감수성으로 보고하지 않는다.

15 균종별 해석 방법 ESBL을 생성하는 Klebsiella 균주와 E. coli
: penicillin, cephalosporin, aztreonam에 감수성이어도 임상적으로는 효과가 없다. Enterobacter, Citrobacter, Serratia : 3세대 cephalosporin의 치료시작후 3-4일내에 내성을 획득할 수 있기 때문에 이들 균종이 반복하여 분리되면 감수성 검사를 시행하는 것이 권장 Chloramphenicol은 소변에서 분리된 균주에 대해서는 통상적으로 보고하지 않는다.

16 Staphylococcus spp. Folate pathway inhibitors Macrolides Penicillins
trim-sulfa(B) Phenicols chloramphenicol(C) Etc rifampin(C) quinupristin-dalfopristin(C) linezolid(B) Macrolides em or azithromycin(B) Tetracyclines tetracycline(C) Fluoroquinolones ciprofloxacin or ofloxacin(C) Lincosamides clindamycin(B) Penicillins penicillin(A) oxacillin(A) Glycopeptides vancomycin(B) teicoplanin(inv) Aminoglycosides gentamicin(C)

17 균종별 해석 방법 Staphylococci
Penicillin 감수성: penicillin계열, cephem계열 및 carbapenems에 감수성 Penicillin에 내성, oxacillin에 감수성 : β-lactamase에 파괴되는 penicillin 내성  β-lactamase에 안정한 penicillin,  β-lactamase inhibitor 복합제, cephems. Carbapenems감수성 Oxacillin (methicillin) 내성: 모든  β-lactam 계열약물에 내성 Penicillin에 내성, oxacillin에 감수성: β-lactamase를 생성

18 균종별 해석 방법 Rifampin은 치료제로서 단독으로 사용하지 않는다.
Quinolone 제제는 치료후 3-4일내에 내성을 획득할 수 있으므로 staphylococci가 반복하여 분리되면 감수성검사가 필요하다. Sulfisoxazole 디스크는 모든 sulfonamide계 항균제 감수성검사의 대표약제로 쓰인다.  

19 Enterococcus spp. Penicillins penicillin or ampicillin(A)
Glycopeptides vancomycin(B) teicoplanin(inv) Macrolides erythromycins(C) Tetracyclines tetracycline(C) Etc rifampin(C) chloramphenicol(C) quinupristin-dalfopristin(B) linezolid(B)

20 균종별 해석 방법 장구균(enterococci)
Cephalosporins, aminoglycosides, clindamycin, cotrimoxazole에 검사 결과에 상관없이 임상적으로 효과가 없기 때문에 감수성으로 보고하지 않는다. Ampicillin : amoxicillin/clavulanic acid와  non-β-lactamase 균주의 ampicillin/sulbactam의 감수성을 예측 penicillin 감수성 : ampicillin, amoxicillin, ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanic acid, piperacillin과 β-lactamase 음성 장구균의 piperacillin/tazobactam  감수성을 예측

21 균종별 해석 방법 장구균은 penicillin, ampicillin 또는 vancomycin과 aminoglycoside 병합요법에 반응하지 않는 aminoglycoside 고도 내성 균주가 있다. 그러므로 혈액, 뇌척수액 검체에서 장구균이 분리될 때는 aminoglycoside와 cell-wall active agents와의 병합 요법에 의한 상승작용에 내성이 있는 지를 검사해야 한다. 장구균의 aminoglycoside 고도내성은 gentamicin과 streptomycin을 검사한다. Vancomycin 내성 장구균(VRE)은 항균제 선택이 매우 제한적이므로 chloramphenicol, erythromycin, tetracycline (doxycycline, 또는 minocycline) 등을 검사할 수 있다.

22 균종별 해석 방법 Haemophilus spp.
패혈증, 뇌막염, 후두개염, 안면 봉와염 등의 심각한 감염병에서 분리된 균주에 대해서는 ampicillin, 3세대 cephalosporin 중 한 개, chloramphenicol, meropenem을 검사해야 한다. Meropenem은 뇌막염 또는 패혈증과 뇌막염이 동반된 경우에 사용된다.

23 균종별 해석 방법 N. gonorrhoeae β-lactamase 양성
: ampicillin, amoxicillin, penicillin에 내성임을 예측 penicillin과  β-lactamase에 모두 내성이면 plasmid-mediated β-lactamase 생성균주이므로 penicillin, ampicillin, amoxicillin에 내성이고 penicillin에 내성이나 β-lactamase 음성이면 chromosomally-mediated β-lactamase 생성균주이므로 고농도 penicillin으로 치료가 가능하다. 

24 균종별 해석 방법 S. pneumoniae Erythromycin 결과는 azithromycin과 dirithromycin의 결과를 예측할 수 있다. Amoxicillin, ampicillin, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone, cefuroxime, imipenem, meropenem은 S. pneumoniae의 치료제로 사용되나 디스크 확산법으로는 결과를 믿을 수 없기 때문에 최소억제농도를 측정해야 한다. Ofloxacin에 감수성이면 levofloxacin에도 감수성이다. Rifampin은 치료제로서 단독으로 사용하지 않는다.

25 균종별 해석 방법 연쇄구균(streptococcus)
혈액과 무균체액에서 분리된 viridans streptococci는 MIC법으로 penicillin 감수성검사를 시행한다. Penicillin, ampicillin, levofloxacin, ofloxacin의 디스크 감수성검사의 결과는 β-용혈성 연쇄구균에만 적용한다. 소변에서 분리되는 균주에 대하여 erythromycin, chloramphenicol, clindamycin 결과는 통상적으로 보고하지 않는다. S. pyogenes 및 S. agalactiae의 일부 균주는 erythromycin과 clindamycin에 내성이므로 이 약제들을 사용할 때는 항균제 감수성 시험이 필요하다

26 2. 한천 희석법 (Agar dilution method)
배지 양이온이 첨가된 Mueller-Hinton agar (pH 7.2∼7.4)에 항균제를 단계 희석하여 각 시험관에 첨가한다. 방법 Macrodilution broth 법(1.0 mL) 4∼5개의 집락을 tryptic soy broth 4∼5 mL에 접종하여 배양한다. 탁도를 McFarland 0.5관에 맞추고 이것을 다시 액체배지를 써서 1:200으로 희석하면 105-6 CFU/mL가 된다. 균 1 mL를 각 시험관에 접종한다.  최종 접종 균수는 5×105 CFU/mL가 되어야 한다. Microdilution broth 법(0.05∼0.1 mL) 상품화된 kit가 차츰 널리 쓰이게 되었다. 통상 검사용으로 사용하기에 편리하다.

27 3. 액체배지 희석법 (broth dilution method)
배지 균종에 따라 차이가 있으나 대부분 Mueller-Hinton agar (pH 7.2∼7.4)를 사용한다. 배지에 검사할 항균제를 단계 희석하여 제조한다. 방법 4∼5개의 세균 집락을 5 mL 액체배지(tryptic soy broth)에 풀어 0.5 McFarland 탁도로 맞추고 10 배 희석한 후 Steers replicator등을 이용하여 배지 표면에 1∼2 μL를 접종한다. 35℃에서 16∼24시간 배양한다. 많은 균주를 동시에 검사하기에 편리하며 통상검사보다는 내성양상을 보기위한 연구용으로 시행한다.

28 4. E test  5×50 mm 플라스틱 스트립에 단계별로 희석한 항균제를 함유시켜 MIC를 측정할 수 있다.

29 항균제 감수성 검사 보고방법 바람직한 감수성검사의 보고방식은 환자에게 부작용이 적고 치료 효과가 높으며
 바람직한 감수성검사의 보고방식은 환자에게 부작용이 적고 치료 효과가 높으며 가격이 저렴한 약제와 용량 을 추천해 주는 것 이상적인 감수성검사 : 환자의 입원시점부터 퇴원시까지 각종 검사 결과를 종합적으로 분석한 후 치료 지침과 추가 검사에 대한 방향을 제시함

30 혈청 살균력 (Serum bactericidal activity)
이 시험은 세균의 감수성 뿐만 아니라 항균제의 체내흡수와 제거영향, 항균제의 단백결합과 대사의 정도, 약제의 상승, 길항 등 상호작용과 같은 영향도 시험결과에 반영되는 장점이 있다. 시험방법은 균액과 환자 혈청을 섞은 후 계대배양한다.

31 Tolerance MBC/MIC비가 32이상
autolytic enzyme defect로 세균성장은 억제되지만 살균은 못하는 상태를 의미한다.

32 β-lactamase 검사 대상 세균 주로 H. influenzae, N. gonorrhoeae, M.(B) catarrhalis가  β-lactamase를 생성하는지 시험하기 위해서 사용한다. 방법 Acidometric method Penicillin이 β-lactamase에 의해 penicilloic acid로 분해되면 산성으로 변한다. Iodometric method Penicillin, iodine 및 전분이 혼합된 용액에서 β-lactamase가  작용하면 iodine이 iodide로 환원되고 전분용액이 암청색에서 무색으로 변한다. Chromogenic cephalosporin β-lactamase에 의해 분해되면 색변화를 일으키는 성질을 이용한 것 nitrocefin(Glaxo)이나 PADAC을 써서 시험함

33 혐기성 세균의 감수성 검사 접종 5개 이상의 집락을 enriched thioglycollate medium에 hemin, vitamin K1과 NaHCO3을 첨가한 배지에 접종한다. 6∼24시간 배양한 후 Brucella broth를 이용하여 0.5 McFarland 탁도로 맞춘다. 35℃ 혐기성 상태로 48시간 배양한다. 배지 Brucella agar + 5% laked sheep blood + vitamin K1 Wilkins-Chalgren agar Broth microdilution 법 - Schaedler's, West-Wilkins, brain-heart infusion, Wilkins-Chalgren 배지

34 결핵균 약제 감수성 검사 결핵균의 내성 특성 검사 방법
결핵균의 특정 약제에 대한 내성 획득은 그 약제에 노출되는 것과는 무관하게 돌연변이에 의해 발생한다. 검사 방법 BACTEC 방법 약제가 들어있는 배지와 없는 배지에 접종하고 약제가 없는 대조배지에는 100배 희석균액을 접종한다. 대조배지 GI (growth index) 값에 비해 약제 배지의 GI가 작으면 처음 접종량의 1%이하만 생존함을 의미하므로 감수성으로 판독한다.   분자생물학 기법을 이용한 방법 Probe 법은 rpoB 유전자의 점돌연변이를 검출하여 rifampin 내성을 확인하는 방법이다. 야생주와 돌연변이 균주의 oligonucleotide를 입힌 strip을 이용하여 검출한다. Ripampin 내성이면 다른 약제에도 내성인 경우가 많다.   다른 방법 Flowcytometry 법, HPLC, E-test, colorimetric method, reporter mycobacteriophage