조직검사학.

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1 조직검사학

2 학습목표 1.조직검사학을 정의한다. 2. 병리학 연구 분야와 조직검사학의 관련성을 설명한다. 3. 조직화학의 개념과 그 의의를 설명한다. 4. 조직검사학의 발달과정을 이해한다. 5. 신선한 조직과 고정한 조직의 조직검사법의 차이를 비교한다. 6. 생체내염색과 초생체염색의 차이를 설명한다. 7. 세포검사와 조직검사의 차이를 비교한다. 8. 조직검사의 의의에 대해 설명한다. 9. 다음 조직검사법의 종류의 차이점을 비교한다. 가. 광학현미경적 검사 나. 전자현미경적 검사 다. 유세포분석법 10. 다음 광학현미경적 조직검사법의 차이점을 설명한다. 가. 조직학적 검사 나. 일반조직화학적 검사 다. 효소조직화학적 검사 라. 면역조직화학적 검사 마. 분바병리학적 검사

3 정상 및 병적 조직의 형태관찰을 위해 필요한 현미경적표본제작 기술을 연구하는 학문
Ⅰ. 조직검사학 정상 및 병적 조직의 형태관찰을 위해 필요한 현미경적표본제작 기술을 연구하는 학문 생물체 ; 유기물질과 무기물질로 구성 → 일정한 형태와 기능을 나타냄. 생물체의 연구대상 상호관련성 1) 생화학(biochemistry) ; 2) 생리학(physiology) 3) 형태학(morphology) 해부학(anatomy) ; 정상적인 형태를 대 상으로 육안적으로 연구 형태학 세포학(cytology) ; 세포를 대 상으로 연구 조직학(histology) ; 조직을 대상으로 연구 병리학(pathology) ; 질병의 원인, 발병기전, 형 태 변화, 기능 변화 및 임상적 의의 등을 연구

4 Ⅰ. 조직검사학 병리학 ; 1) 임상병리학(clinical pathology) : 환자로부터 채취한 검체를 대상으로 생물학 및 화학적 기법을 사용하여 질병을 검사하는 분야이며 2) 해부병리학(anatomical pathology) ; 생검, 부검, 수술검체, 탈락세포 등의 검체를 대상 형태 관찰 수준에 따라 육안적, 광학현미경적(조직학적, 세포학적), 전자현미경적 방법들을 사용 하여 질병을 진단 외과병리학(surgical pathology) : 생검 및 수술검체만 주로 검색하는 분야 장기병리학 (organ pathology) 조직병리학(histopathology) 세포병리 학(cell pathology) 소기관병리학(organelle pathology) 분자병리학(molecular pathology

5 Ⅰ. 조직검사학 초기 조직검사학 현미경 관찰에 의존하는 형태학적 측면을 주요 대상
헤마톡실린-에오신 (hematoxylin-eosin : HE)염색을 기초로 함. 조직화학( histochemistry) : 생물체의 형태 특성인 물질, 형태, 기능을 규명하고 생물체의 본질을 규명하기 위한 생화학적, 형태학적 및 생리학적 연구방법 조직세포의 구조와 연관시켜 연구 하는 과학 검출 방법과 검출 물질의 종류; 일반조직화학(general histochemistry), 효소조직화학(enzyme histochemistry) 및 면역조직화 학(immunohistochemistry) 최근에는 분자생물학적 기법을 조직진단에 이용 (제자리부합법(in situ hybridization ; ISH), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR) Real-Time PCR, Sequencer, NGS(Next Generation sequencing; 차세대염기서열)

6 II. 조직검사학의 발달사 조직검사학 ; 생물체의 형태학에 기초하는 연구 분야인 조직학, 세포학, 병리학의 발전과정
에서 필수적으로 요구되 는 기술학 레벤후크(Leeuwenhoek, 1632~ 1723) ; 현미경을 이용 세균, 횡문근, 수정체의 섬유근관찰 영국의 훅(Hooke, 1635~1703) ; 세포(cell)라는 명칭 이탈리아의 모르가니(Morgagni, 1682~1771) ; 장기병리학 삐샤(Bichat, 1771~1802) ; 조직병리학으로 발전 비르호우( Virchow, 1821~1902) ; 세포병리학 [ 모든 개체의 질병은 세포에서 유래] 파파니콜라우(Papanicolaou, 1883~1962) ;세포학(diagnostic cytology)의 기틀 크눌(Knoll)과 루스카(Ruska)( 1931년) ; 전자현미경 개발 왓 슨과 크릭(Watson and Crick) ; DNA 이중나선 구조

7 II. 조직검사학의 발달사 표본제작기술의 기본 단계 발전 세포가 얇고 투명해야 하는 것이 필수적인 요소이다.
조직분리 기법(dissociation method) ; 조직을 좀 더 작은 조각으 로 잘게 찢어 내는 방법 커밍스(Cummings) ; 전체 형태 보존이 가능한 절편(section)을 제작하는 박절 기술 개발 박절기 활주식 박절기( sliding microtome) ; 1866년 히스(Hiss) 회전식 박절기( rotary microtome) ; 1886년 파이퍼(Pfeifferr) 발명 봉입제 ; 처음에는 물에 붙여서 봄 1835년 쿠퍼(Cooper) ; 캐나다발삼(canada balsam)

8 II. 조직검사학의 발달사 염색 ; 조직 내의 구성벙분을 구별 – 가시성(visibility)
고정 ; 1860년 뮬러 ; 조직 알코올처리 후 단단하게 됨을 확인 염료(dye) ; 1858년 게르라히 – 성분에 따라 색상이 다르다. 연지벌레(cocchineal insects)의 몸 통으로부터 추출한 카민(carmine)을 사용하여 핵과 다른 성분들을 염색 * 1865년 보머(Bohmer) ; 헤마톡실린(hematoxylin)- 서인도 제도에서 자생하는 록우드(logwood)로 부터 추출한 염료 처음 생물학적 염색에 사용 * 1970년대 중반 ; 면역조직화학(immunohistochemistry : IHC)과 면역세포화학 (immunocytochemistry : ICC)을 사용 특정 세포나 조직으로부터 단백질들의 위치 확인이 가능하게 되었다. 1980년 분자생물학의 출현으로 PCR , Real-Time PCR, Sequencing , NGS(Next generation sequencing , 차세대염기서열분석)

9 III. 조직검사의 종류 조직검사 관찰 방법 ; 1. 채취한 조직이나 세포를 살아있는 상태로 관찰하는 방법
2. 세포와 조직을 즉시 동결(frozen) 또는 고정한 후 관찰하는 방법 살아 있는 조직세포의 검사 생체염색(vital staining)이나 위상차현미경(phase contrast microscope)을 활용한 특수 방법 사용 ①초생체염색(supravital staining) ; methylene blue, brilliant cresyl blue ex) 망상적혈구(reticulocyte) ②생체내염색(intravital staining)

10 III. 조직검사의 종류 2. 고정 및 동결 조직세포의 검사 1) 세포학적 검사(cytological test)
체취방법 (Sampling method)에 따라 (1) 탈락세포 (박리 세포 ; exfoliative cytology) ; 공동기관( Hollow organs) ; 기구사용 안함. 자연스럽게 떨어져 나온 세포 For Screening 질분비물(vaginal secretions), 객담(sputum), 요(urine), 체강액(body fluid) 등 (2) 세침천자흡인세포학(Fine-Needle Aspiration Cytology/Biopsy, FNAC/FNAB) ; 고형기관 (Solid organs) 흡인천자세포학 (Aspiration Biopsy Cytology (ABC)) ; 흡인/생검세포학 For Diagnosis

11 III. 조직검사의 종류 (2) 세침천자흡인세포학(Fine-Needle Aspiration Cytology/Biopsy, FNAC/FNAB) ; 고형기관 (Solid organs) 흡인천자세포학 (Aspiration Biopsy Cytology (ABC)) ; 흡인/생검세포학 촉진성 병변(palpable lesions) ; 종괴처럼 피부 표면에서 쉽게 만져지는 병변 (갑상선, 유방, 표재성 림프절 부위 등) 비촉진성 병변(Non-palpable lesions) ; 인체 깊은 부위로부터 검체 채취가 필요한 병변 (간, 콩팥 등) 초음파(ultrasonography)나 전산화단층촬영기(computed tomography)와 같은 영상장치를 병행 보통 악성을 확정 진단하거나 배제하기 위해 이용한다. 검체 type에 따라 (1) 부인과 세포학 (Gynecological Cytology) 산부인과 검체 (자궁경부) (2) 비부인과 세포학 (Non-Gynecological Cytology) 산부인과 검체 제외한 것

12 III. 조직검사의 종류 진단 세포학의 적용범위 ◎ Gynecological cytology의 임상적 의의
악성종양 발견 -- 악성종양 - 진료 및 치료방향에 도움 2) 예후진단(Prognosis) - 악성종양 전단계(Precancerous lesion)를 발견하는데 중요 - 산부인과 ; 6개월~1년에 1번씩 정기검사 시 자궁암 조기발견에 유용. 3) 염증의 발견 -- 염증이 많으면 자궁암 발생율이 높을 수 있음. - 염증원인 병원체 발견 ; ex) Trichomonas vaginalis, gonococcus, fungus(candida), veneral disease(VD)등 - 염증 후 세포의 특이적 변화 발견 ex) herpes, condyloma, chlamydia, hemophilus

13 III. 조직검사의 종류 진단 세포학의 적용범위 4) 기생충 parasite -- 폐디스토마(P. W), 간디스토마(C. S) 5) 호르몬 평가 a)무월경의 원인 분석(Amenorrhea analysis) -- 호르몬에 영향받은 세포검사 b)불임(Infertility) -- ex) 배란이 안 됨. c)외부약제로 인한 호르몬의 변화 (Exogenic drug effect) ex)피임약 ; 호르몬제 -- 배란 억제.→Progesterone이 있어 상피세포 변화 초래 6) 성 감별 (Sex differentiation) ---- Barr body 유무 - 선천적 이상 ; 외모 여자 ＋ 내부 남자 = 양성 - 병적 이상 7) 이물질(foreign body)의 발견

14 III. 조직검사의 종류

15 III. 조직검사의 종류 2) 조직학적 검사(histological test)
박절기를 이용하여 조직괴로 부터 얇고 투명 한 절편을 제작하여 관찰하는 방법 그 위에 여러 종류의 염색을 하여 조직세포 구조를 관찰 조직절편의 해석 (절단면)

16 III. 조직검사의 종류 2) 조직학적 검사(histological test)
현재 조직 진단에 사용되는 검사는 박절기를 이용한 조직절편 검사가 주류 조직이 절단하기에 적당한 강도 로 유지 조직편을 1)동결시키거나 2)파라핀, 셀로이딘, 합성 수지를 조직 속으로 침투하여 단단히 굳힌다. 조직검사의 목적에 적합한 절편의 두께 ; 평균 3~5 μm - 지방조직, 신경섬유, 혈관 ; 10~25 μ m 세포 내 초미세구조(ultrastructure)의 관찰 ; 50~100 nm (0.05~0.1 μ m) - EM ; 초미세박절기(ultramicrotome)로 초미세박절편(ultrathin section)을 필요 탈회(decalcification) ; 뼈조직과 같이 석회가 침착된 딱딱한 조직 (칼슘 제거)

17 III. 조직검사의 종류 (1) 일반 조직염색표본 제작과정

18 목적에 따라 효소조직화학, 면역조직화학(형광항체법, 효소항체법), 전자현미경법 등
III. 조직검사의 종류 (1) 일반 조직염색표본 제작과정 목적에 따라 효소조직화학, 면역조직화학(형광항체법, 효소항체법), 전자현미경법 등 고정( fixation) ; 인체로부터 생검이나 수술에 의해 채취한 검체의 사후 변화를 막고 그 후 진행 과정에서 조직이 분해되 는 것(단백질변성용액 ; 포르말린) 절취( gross cutting) ; 육안표본 검사의 한 과정이며 조직 크기는 1x2x0.4 cm의 크기로 잘라낸다. 병변부위와 정상부위가 함께 포함되도록 자른다. 탈수( dehydration) ; 파라핀 포매를 위해 조직으로부터 수분을 제거하는 과정 저농도의 알코올로부터 점진적으로 고농도의 알 코올(70% → 80% → 90% → 95% → 100%)로 이동.

19 III. 조직검사의 종류 (1) 일반 조직염색표본 제작과정 투명( clearing) ;
탈수를 위해 사용된 조직 내 알코올을 제거하고 파라핀에 혼합될 수 있는 중간제(예:자일렌)에 조직을 둔다. 파라핀 침투( paraffin infiltration) ; 조직 내에 남아 있는 중간제(탈알코올제)를 제거하고 조직 내로 파라핀을 채우는 과정 파라핀 포매( embedding) ; 파라핀 블록을 만들기 위해서 조직을 파라핀으로 덮는 과정. 박절( microtomy) ; 현미경 관찰을 위해 조직을 절편(sections) 상태로 얇게 잘라내는 과정이다.

20 III. 조직검사의 종류 일반 조직염색표본 제작과정 ⑧ 염색( staining) ;
일반 구조의 관찰에는 헤마 톡실린-에오신(hematoxylin-eosin:HE)염색을 사용한다. 봉입( mounting) ; 염색이 끝난 절편을 저농도 알코올로부터 고농도 알코올로 이동하여 탈수하고 중간제(예 : xylene)로 알코올을 제거한 후 캐나다발삼(canada balsam)과 같은 봉입제를 사용하여 커버글라스를 덮는다.

21 III. 조직검사의 종류 (2) 동결절편 제작과정 동결절편법( frozen section technique) ;
냉동미세절단기 (cryostat)를 이용하여 신선한 조직편을 젤리모양의 포매제(OCT compound)에 포매하고 냉동미세절단기에서 동결시켜 조직표본을 제작하는 방법이다.

22 III. 조직검사의 종류 (2) 동결절편 제작과정 조직화학적 검사(효소조직화학, 형 광항체법, 효소항체법)에 활용할 수 있다.
수술 중 신속진단에 많이 사용되고 있다. 3. 조직검사법의 종류 광학현미경적 검사법 조직형태학적 검사 염료를 사용하여 조직의 형태를 염색하여 관찰하는 방법 목적에 따라 일반 염색, 결합조직 염색, 신경조직 염색, 조직 내 병원미생물 염색, 도은법(silver impregnation)

23 III. 조직검사의 종류 3. 조직검사법의 종류 광학현미경적 검사법 (2) 조직화학적 검사
조직 내 각종 유기, 무기물질을 대상으로 염료를 포함한 여러 화학물질을 사용하여 검출하는 방법 목적에 따른 분류 일반 조직화학( general histochemistry) 유기질 ;핵산, 탄수화물,지질 등 / 무기질 검출 ;철, 칼슘,구리 등 대상 물질 ; 핵산 (nucleic acid ), 탄수화물 (carbohydrate), 지질 (lipid) 및 무기질 (inorganic) 효소조직화학( enzyme histochemistry) 효소와 기질 사이의 특이적인 반응을 이용하여 조직절 편 위에서 효소활성부위를 가시화 (visualization)하는 방법

24 III. 조직검사의 종류 (2) 조직화학적 검사 ③ 면역조직화학( immunohistochemistry) ;
조직절편 위에 존재하는 항원(antigen) 을 검출하기 위해 항체(antibody)를 사용 특이도(specificity)와 민감도(sensitivity)가 매 우 높은 염색법. 형광항체법(fluorescent labelled antibody method) ; 형광염료(FITC) 효소항체법(enzyme labelled antibody method) ; 효소(enzyme)를 표지(labelling)

25 III. 조직검사의 종류 유전체조직화학( genomic histochemistry)
① 제자리부합법(in situ hybridization : ISH) 분자병리학적 방법; ISH는 핵산탐심자(nucleic acid probe)를 이용하여 조직 내의 DNA 또는 RNA의 염기서열(base sequence)을 검출하는 방법 파라핀 절편에서도 가능 ② 중합효소연쇄반응( polymerase chain reaction : PCR) PCR은 DNA중합효소(DNA polymerase)를 이 용하여 DNA의 특정역(target sequencing)을 몇 시간 내에 수십만 배로 증 폭(amplification)시키는 방법이다. 변성과정(denaturation) ; 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 분리 어닐링(annealing) ; 합성 시발체(primer)가 상보적인 주형 DNA 단일가닥에 특이적으로 결합 신장과정 (extention) ; DNA 중합효소에 의한 시발체의 신장 PCR 산믈에 대한 해석 ; 전기영동(electrophoresis)

26 III. 조직검사의 종류 유전체조직화학( genomic histochemistry) 세포자멸사( apoptosis) 검사
세포자멸사 ; 핵의 이중가닥 (double strand) DNA가 절단되어 180~200 염기쌍(base pair) 길이의 배수로 절단 괴사(necrosis) ; 무작위적인 DNA 분해에 의한 것과 비교된다. TUNEL( Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling) 검사

27 III. 조직검사의 종류 2) 전자현미경적 검사법 (1) 투과전자현미경법( transmission electron microscopy : TEM) 투과전자현미경은 전자선(electron beam)과 철과 코일로 만든 전자렌즈(electron lens)를 사용 초미세구조(ultrastructure)를 검사하는 현미경. (2) 주사전자현미경법( scanning electron microscopy : SEM) 검체표면에 가는 전자선(electron probe)을 주사(scanning)하여 검체로부터 방출되는 전자 및 전자기파(electromegnetic wave)를 신호로 하여 브라운관(cathode ray tube : CRT, 음극선관) 위에 밝기의 변화로서 상을 나타내도록 만든 현미경 주로 검체의 표면의 미세 형태를 조사할 때 사용된다

28 III. 조직검사의 종류 3) 유세포분석법( flow cytometry)
특정 세포의 수 또는 DNA함량 등에 대한 정보를 얻을 수 있고 그 결과를 컴퓨터에 의해 통계적으로 처리하면 세포동력학적 변화(cell kinetic change)를 알아 낼 수 있다.