Ⅷ. 병원체에 대한 식물체의 방어기작 1. 유전자에 의해 조절되는 식물체의 방어 및 저항성 기작

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1 Ⅷ. 병원체에 대한 식물체의 방어기작 1. 유전자에 의해 조절되는 식물체의 방어 및 저항성 기작
2. 기존 구조적 방어 및 화학적 방어 3. 필수요소의 결여를 통한 방어 4. 유도 구조적 방어 및 생화학적 방어 5. 과민성반응에서의 유도생화학적 방어(race-특이적, 단일유전자, R 유전자, 수직)저항성. 6. 식물에 의한 병원균 독소의 해독 7. 병원체에 대한 식물체의 면역 8. 전신적 유도저항성

2 (4) 유도 생화학적 방어 (a) 비기주 저항성 진화에 의해 이루어진 병원체와 기주식물의 불친화적 관계를 통해 나타나는 저항성을 말한다. 분류학적으로 관계가 없는 식물 (감자와 참나무 또는 참나무와 밀)이더라도 식물/병원체 관계상에서 보면 비기주 저항성이 나타나는데, 주로 비특이적인 자극에 의해서 생성된다. 이와 같은 방어 기작은 식물에서의 물리 해부학적 요인과 구조물, 독소의 존재 및 필수화합물의 부재 등으로 나타난다. 분류학적으로 관계가 있는 식물(감자와 토마토, 보리와 밀)의 식물/병원체 관계에서는 비기주 저항성이 병원체를 인지하는 특정 물질의 자극에 의해서 나타난다. 어떤 경우에는 비기주 저항성이 단일 유전자에 의해 나타나기도 한다.

3 유도생화화적 방어- 비기주저항성 비기주저항성은 이해하기에 어려움이 많다. 예를 들면 Pseudomonas syringae pv. syringae는 강낭콩은 침해하지만 비기주인 완두는 침해하지 않는다. 이 세균이 침입하였을 때 완두에서는 과민성반응이 일어나는데, 이는 비기주인 완두에서 방어반응을 유도하는 세균의 유전자가 발현되었기 때문이다. 다른 예로, 감자 역병균 Phytophthora infestans는 담배인 Nicotiana benthamiana를 침해하지 않는다. 하지만 담배 세포의 괴사를 유도하는 단백질을 생성하는 “비병원성 유사 유전자(avirulence-like gene)”가 병원균에 존재하지 않으면 담배에서의 비기주 저항성은 발현되지 않는다. 이는 식물/병원체 상호관계에서 “비기주 비병원성유전자(nonhost avirulence gene)”의 결핍이 비기주식물을 저항성으로 만드는 유일한 경우이다. 그러므로 만약 비병원성유전자에 의해 유도 되는 세포 괴사 반응이 저항성에 관여한다면 이 경우에는 비기주 저항성이 최소한 한 개 이상의 요소에 의해 조절되는 것으로 여겨진다 (적어도 비기주 비병원성유전자(nonhost avirulence gene)”의 결핍 요인에 의하여 조절, 그리고 기타 다른 요소).

4 다른 경우로는 곡류에서 비기주 저항성의 예를 볼 수 있는데(보리 흰가루병균과 밀 관계 또는 밀 녹병균과 보리 관계),
- 이는 유전자 대 유전자 관계와 비기주 저항성이 elicitor 인식과 과민성반응에 의한 저항성 기작으로 나타난다. - 병 저항성은 항상 기주의 병원체의 인식에 의해서만이 나타나는 것이 아니라, 다수유전자 또는 양적 저항성에 의해서도 나타나는데, 다양한 구조물 또는 화학적 방어기작에 의해서 저항성이 발현된다.

5 또한 밀에 감염하는 Gaeumannomyces graminis f. sp. tritici
에 대해 귀리는 비기주 저항성이 나타나지만 귀리병원균인 G. graminis f. sp. avenae에 대해서는 감수성이 나타난다. -- 귀리가 밀 마름병균에 대해 저항성인 것은 귀리 뿌리에 항균성 avenacin이라는 saponin 성분이 있기 때문이다. -- 이 화학물이 귀리 마름병균에도 독성이 있지만 귀리 마름병균에서는 saponin을 해독하는 효소가 있기 때문에 귀리를 감염시킬 수 있다. -- 그러나 saponin 합성이 결여된 변이체 귀리식물에서는 밀 마름병균이 침입에 성공적이었다. -- 이를 통해서 비기주 저항성은 몇몇 기주-미생물의 상호관계에서 볼 수 있는 인식작용보다는 직접적인 방어기작에 의해서 나타나는 것을 보여준다.

6 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) 저항성 --- 과민성 반응-----
과민성반응은 병원체의 생장을 제한하는 원인으로 여겨지며 병원체의 생장을 제한하는 방법 인위적인 조건에서 비기주식물의 조직 속으로 여러 속의 식물병원세균을 주사했을 때 과민성반응이 진전된다. 과민성반응은 잎에 처음 수침 상으로 되는 커다란 부위를 형성하고 그 부위는 접종 8~12 시간 안에 괴사되고 붕괴된다. 조직 속으로 주입된 세균은 괴사병반 속에 포위되고 일반적으로 급격하게 죽는다. 과민성반응은 식물병원세균의 병원성 균주들을 비기주식물체나 저항성 품종에 주입했을 때와 비병원성 균주들을 감수성 품종에 주입했을 때 발생한다. 모든 경우의 저항성이 과민성반응 때문에 생기는 것은 아닐지라도, 과민성반응 유도 저항성이 절대기생체(균류, 바이러스, 몰리큐트 및 선충) 뿐만 아니라 비절대기생체(균류와 세균)가 연루된 수많은 병에서 설명되고 있다.

7 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) 저항성 --- 과민성 반응-----
기주식물체에 의한 elicitor의 인식은 공격받은 식물세포와 주위 세포에서 일련의 생화학적 반응을 활성화시켜 새로운 세포기능이나 변경된 세포기능을 수행하도록 하고 새로운 방어 관련 화합물이나 더욱 활성화된 방어 관련 화합물을 만들게 한다 (그림 6-11). 가장 흔한 새로운 세포기능과 화합물은 급격한 산화반응의 야기(rapid burst of oxidative reaction); 이온이동의 증가, 특히 세포막을 통한 K+와 H+의 이동의 증가; 세포막의 붕괴와 세포내부 구획화(cellular compartmentalization)의 상실(그림 6-12); 세포벽 구성성분과 페놀화합물과의 상호결합과 식물세포벽의 강화; protein kinases의 일시적인 활성화(상처나 살리실산에 의해 유도되는 kinases); 파이토알렉신 같은 항미생물 물질의 생성; 카이틴분해효소 같은 항미생물성 단백질, 소위 병원성관련 단백질의 형성 등을 포함한다.

8 그림 6-11

9 세포막의 붕괴와 세포내부 구획화 (cellular compartmentalization)의 상실(그림 6-12)

10 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) -------저항성 감염 초기의 유전자 유도------ 
현대 기술의 발달[경쟁적 차감혼성화(suppression subtractive hybrization; SSH), cDNA 라이브러리 구축, expressed sequence tag(EST)결정, 대용량 염기서열분석, DNA microarrays]로 병원체와 식물간의 친화적 및 불친화적 상호관계에 의해 발현이 유도되는 식물 유전자를 발견하고 동정할 수 있게 되었다. 특히, DNA microarrays를 통해서는 동시에 수천의 유전자 발현에 대한 정보 분석이 가능하게 되었다. 예를 들면 Phytophthora infestans와 감자의 친화적 관계에 있어서 43 유전자가 유도되고 그 중 10개는 감염으로 인해 증가된다. 증가되는 단백질로는 이미 알려진 ß-1,3-glucanase와 유사한 단백질도 있고 해독(detoxification)에 관련하는 단백질도 있으며 전에 알려지지 않았던 단백질도 있다.

11 A DNA microarray is a multiplex technology used in molecular biology and in medicine.
It consists of an arrayed series of thousands of microscopic spots of DNA oligonucleotides, called features, each containing picomoles of a specific DNA sequence. This can be a short section of a gene or other DNA element that are used as probes to hybridize a cDNA or cRNA sample (called target) under high-stringency conditions. Probe-target hybridization is usually detected and quantified by detection of fluorophore-, silver-, or chemiluminescence- labeled targets to determine relative abundance of nucleic acid sequences in the target.

12 In standard microarrays, the probes are attached to a solid surface by a covalent bond to a chemical matrix (via epoxy-silane, amino-silane, lysine, polyacrylamide or others). The solid surface can be glass or a silicon chip, in which case they are commonly known as gene chip or colloquially Affy chip when an Affymetrix chip is used. Other microarray platforms, such as Illumina, use microscopic beads, instead of the large solid support. DNA arrays are different from other types of microarray only in that they either measure DNA or use DNA as part of its detection system. DNA microarrays can be used to measure changes in expression levels, to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) (see uses and types section), in genotyping or in resequencing mutant genomes. Microarrays also differ in fabrication, workings, accuracy, efficiency, and cost (see fabrication section). Additional factors for microarray experiments are the experimental design and the methods of analyzing the data (see Bioinformatics section). From Wikipedia, the free encyclopedia

13 DNA microarray

14 기타 애기장대를 이용한 유전자 유도에 관한 연구가 있음(교과서 참조)
과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) 저항성 감염 초기의 유전자 유도------ 벼에 Magnaporthe grisea를 접종한 지 48시간 후에는 임의로 선발한 619 유전자 가운데 359개가 그 동안 보고되지 않은 유전자임을 알아냈다. EST법(expressed sequence tag)을 이용하여 유전자 기능을 알아본 결과 260EST 중 124EST가 기능이 분석되었으며 그 중 가장 큰 그룹에 속하는 21%가 스트레스나 방어반응에 관여하는 유전자로 밝혀졌다. 많은 유전자가 새롭게 발견되었지만 다른 한편으로는 이미 감염에 관련된 것으로 알려져 있는 유전자들도 있다. 예를 들면 벼의 peroxidase유전자는 벼가 세균 Xanthomonas oryzae pv. oryzae에 감염되었을 때 발현되는 유전자로 알려져 있다.  기타 애기장대를 이용한 유전자 유도에 관한 연구가 있음(교과서 참조)

15 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) ------- 식물방어유전자의 기능 분석-----
병원균 접종 또는 물질 처리 후 일정한 시간이 지나면 수십에서 수백 개의 유전자가 발현되는데, 이는 식물의 생리적 과정에 적용된다는 것을 의미한다. 특정 유전자의 기능을 측정한다는 것은 유전자 개별적으로 수행하는 기능을 조사한다는 것인데, 이는 매우 어려운 작업이다. 왜냐하면 많은 유전자가 유사한 기능을 수행하기도 하고 또한 어떠한 기능은 서로 다른 다양한 유전자에 의해 수행되기도 하기 때문이다. 또한 여러 식물의 유전자군(gene families)은 100개 또는 그 이상의 유전자로 구성되어 있으며, 어떤 유전자군은 전사인자(transcription factors)와 관련되어 대부분의 유전자들은 방어반응과 특별히 연결되어 있다.

16 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) ------- 식물방어유전자의 기능 분석-----
microarray 방법으로 동정된 유전자의 식물체 내에서 기능은 다음의 여러 방법으로 분석될 수 있다. 즉, 전사 후 발현억제(posttranscriptional silencing), 유전자 과다발현, transposon 이나 T-DNA를 이용한 유전자 삽입 변이 방법으로 유전자 제거 실험,  프로모터 trap 등이 그것이다. 유전자 기능 분석을 위해 형질전환 식물을 이용하면 세대 기간이 길어 많은 시간이 소요되고 전환된 유전자의 발현에 있어서 많은 변이가 있는 단점이 있다. 전사 인자 (transcription factor)을 동정하고 이들이 방어-관련 유전자의 프로모터(promotor)에 결합하는 부위를 알면 어떻게 방어 유전자가 발현되는지 알 수 있다. 따라서 현재 생물정보학적 도구를 이용하여 프로모터 부위에 공동으로 조절하는 요인을 알아 낼 수 있는데, 생화학적, 세포학적, 발생학적 대사과정에 관여하는 유전자는 동일한 전사 요인에 의해 조절된다는 것을 알게 되었다. 

17 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) ------- 저항성 R 유전자 단백질의 분류----
대부분 R유전자는 유전자 군으로 되어있는데 구조와 기능에 따라 5가지로 구분할 수 있다 (그림 4-14, 표4-6:p157). (해독 효소를 생성하는 R-유사 유전자 Hm1은 제외 됨) (1) R유전자 Pto는 신호전달에 역할을 하는 serine-threonine protein kinase를 생성한다. (2) 벼에서 R유전자 Xa21은 세포외 leucine repeats가 많은 transmembrane 단백질을 생성하고 kinase-유사 단백질의 수용체로서 역할을 하며 phospho kinase에 신호전달에 역할을 하는 cytoplasmic serine-threonine kinase를 생성한다.

18 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) ---- 저항성 R 유전자 단백질의 분류----
(3) 담배의 N1과 아마의 L6유전자, 애기장대의 RPP5는 세포질적 단백질을 생성한다. - leucine-rich repeats - Toll/interleukin 1 수용체와 유사한 nucleotides(NBS)와 domain(TIR)의 결합 부위를 가지고 있다. (4) RPS2와 RPM1과 같은 세포질 단백질: - LRR과 NBS를 가지고 있지만 putative leucine zipper domain을 함유하는 coil domain을 가지고 있다.

19 R단백질은 애기장대 유전자 RPW8.1과 RPW8.2가 후보인데 이들은 광범위한 흰가루병균에 대한 개별적인 저항성을 나타낸다.
(5) 토마토의 Cf2-Cf9유전자 - leucine를 함유하는 단백질로서 세포막 밖에 존재하지만 세포막과 결합되어 있는 단백질을 생성한다 - 이들 유전자는 avr 유전자의 발현으로 생겨나는 세포외 또는 세포내의 elicitor의 수용체로서 역할을 한다. 예를 들면 avr9의 경우에는 22개의 아미노산으로 구성된 elicitor가 생성되며 이들은 Cf9유전자로부터 생성된 수용체와 결합한다. R단백질은 애기장대 유전자 RPW8.1과 RPW8.2가 후보인데 이들은 광범위한 흰가루병균에 대한 개별적인 저항성을 나타낸다. RPW8 단백질은 NBS-LRR 단백질과 유사하게 살리실산에 의존하는 국부적 저항성을 유도하지만 중요한 차이점은 광범위한 저항성을 나타낸다는 점이다.

20 과민성반응에서의 유도 생화학적 방어 (레이스-특이적, 단일 유전자, R 유전자, 수직) ------- 저항성 R 유전자 단백질의 분류----
식물의 수용체는 구조적 특성에 따라 수용체-유사 단백질 kinase(RLKs), histidine kinase 수용체, 여러 개의 transmembrane domains 가진 수용체로 나눌 수 있다. 식물이 병원체의 인식에 관여하는 가장 중요한 수용체는 RLKs인데 각각의 식물 종마다 수백 개씩 가지고 있다. RLKs는 신호 인식에 관여하는 세포외 domain과 transmembrane domain, 그리고 세포의 신호 전달의 초기 역할을 하는 세포질 kinase domain을 지니고 있다. 지금까지 연구된 모든 RLKs는 serine-threonine 유형의 kinases인데 세포외 domain의 구조적 특성에 따라 수용체-유사 단백질 kinase는 여러 종류로 나눌 수 있다 (그림 6-13). 식물에는 RLKs가 다양하게 많은 수로 존재하는데, 이는 RLK가 많은 수의 다양한 자극뿐만 아니라 식물-병원체 상호관계에 대한 인식에 관여하는 것으로 생각된다.

21 Receptor like kinase 모식도
Edpidermal growth factor Cystine motif Transmenbrane domain 그림 6-13

22 기주식물에 의한 병원균 Avr단백질의 인식작용
비록 Avr유전자와 상보되는 많은 클론화된 R유전자에 대한 연구가 계속해서 증가되고 있지만 R 유전자와 Avr유전자 산물과 직접적인 상호관계를 말해주는 기주-병원체 상호관계에 대한 연구는 많지 않다. 많은 기주-병원체 관계에서 R과 Avr단백질 사이에 물리적 관계는 없으며 R단백질에 의한 Avr 단백질의 인식도 간접적으로 일어난다. 즉, Avr단백질의 적어도 1/3 부분만이 결합하고 인식된다. 이는 Avr단백질의 제3의 구성성분과 과민성반응-유도 능력 정도와의 상관관계가 존재한다는 것을 의미한다. 제 3의 구성성분은 Avr단백질의 공동수용체일 수도 있고 Avr단백질의 병원성 target일 수도 있다. Avr단백질이 그의 병원성 target에 결합하는 것은 그의 병원성 target의 “guardian"로 작용하는 R 유전자의 신호로서 역할을 하고 방어반응을 생성하여 병원체를 무찌른다. 그러나 R 단백질의 결합이 안 이루어지면 방어반응이 일어나지 않고 기주의 감수성을 유도하여 병원체가 승리한다. 물론 만약 제 3의 구성성분이 정말 병원성 target이라면 Avr단백질의 병원성에 대한 기능과 그의 과민성반응-유도 능력과 상관관계를 기대해 볼 수 있다.

23 R과 Avr 유전자의 식물의 방어반응 활성화  일단 R단백질이 직접적으로나 간접적으로 Avr 단백질을 인식하면 저항성 반응을 유도하는 신호체계가 가동된다. 신호체계에 관여하는 몇 가지 물질은 밝혀졌지만 아직도 R유전자에 의한 물질 생성 기작과 식물 방어반응을 유도하는 신호전달물질은 밝혀지지 않았다. R유전자들이 서로 구조적으로 유사하다는 점을 고려해 볼 때, 병원체 단백질을 인식한 후 식물에서는 공통의 신호전달체계가 일어나는 것으로 생각된다. 이는 여러 가지 R 단백질에 의해 활성화되는 저항성 기작이 유사하다는 점을 보아도 알 수 있다. 이러한 반응에는 보통 급격한 이온화, superoxide와 nitric oxide의 생성, 세포 괴사가 일어나는 과민성반응 등이 포함된다. 또한 R 단백질의 의해 생성되는 몇 가지 신호전달 물질도 알려져 있다.

24 ④ Phytoalexin에 의한 감염의 제어
- 병원체가 기주체에 침입한 다음, 양자의 상호작용의 결과로 병원체의 발육을 저지하는 물질이 기주측에서 생기는데 이를 phytoalexin이라 한다. → Müller와 Börger의 실험(1939, 1940) : 감자 → Cruickshank(1963)의 실험 : 완두의 pisatin ⇒ 생성된 phytoalexin의 종류는 기주식물의 종류에 따라 결정되며, 접종된 균의 종류와는 관계가 없다. ⇒ 일반적으로 비친화성의 식물이 감염되었을 때응 병원체의 생육을 저지할 수 있는 농도의 phytoalexin을 생산하며, 친화성의 식물에서는 phytoalexin을 생성하지 않거나 병원체가 생육저해를 받지 않는다. → Oku 등(1975, 1976)의 실험 : 순활물균인 흰가루병균 ⇒ 두 개의 phytoalexin의 생성시기 ⇒ 감염초기의 phytoalexin의 생성여부가 흰가루병균의 감염의 여부와 관련

25 ⑤ 감염에 의한 페놀성분의 증가 - arbutin → 배나무화상병(병원균; Erwinia amylovora)의 저항성 - phlorizin → 사과나무검은별무늬병(병원균; Venturia inaequalis)의 저항성 - chlorogenic acid → 채소류 반쪽시들음병(병원균; Verticillium albo-atrum)의 저항성 - phloretin, phaseollin, pisatin, orchinol 등