Western blot.

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1 Western blot

2 11/17일 실험 개요 Western blot Cell harvest Cell lysis 단백질 정량 (Sampling)

3 실험 개요 Gel electrophoresis (SDS PAGE) Transfer Blocking
Primary, secondary antibody incubation Developing (using film)

4 Sampling Introduction

5 Introduction SDS-PAGE

6 Introduction SDS-PAGE

7 Introduction Western blot

8 Introduction Transfer

9 Introduction Blocking
단백질의 Transfer 되지 않은 부분이 다른 단백질로 오염되거나 antibody가 붙을 수 없도록 Skim milk 나 BSA 등으로 Block 해주는 과정

10 Materials & Methods Western blot 표를 보고 loadin할 gel을 만든다
Running Gel 10% gel 10ml H2O 4.0 30% acrylamide mix 3.3 1.5 M Tris (pH8.8) 2.5 10% SDS 0.1 10% ammonium persulfate TEMED 0.006 1)15ml tube에 각 각 Running Gel와 Stacking Gel을 만든다. (Stacking gel에는 TEMED를 넣지 말 것!) 2)cassette에 Running Gel을 l넣는다. 3)Gel이 중화되면 Stacking Gel에 TEMED를 넣고 cassette에 넣는다. 4) Comb을 조심히 넣고 중화시킨다. (loading 할 위치를 표시해준다) Stacking Gel 10% gel 4ml H2O 2.7 30% acrylamide mix 0.67 1.5 M Tris (pH6.8) 0.5 10% SDS 0.04 10% ammonium persulfate TEMED 0.004 <!>TEMED를 넣으면 굳기 시작하기 때문에 마지막에 넣을것! <!>TEMED를 넣고 나서 빠르게 cassette에 넣어주기.

11 Materials & Methods Western blot Comb을 양쪽 끝을 잡고 흐트러지지 않게 제거한 후 물로 세척
Cassette 밑의 스티커를 제거하고 Gel tank에 넣은 후 고정시킨다 Running buffer를 채운다 Marker와 이전시간에 준비한 sample을 gel에 로딩한다 80V로 30분 running 120V로 1시간 30분 정도 running

12 Materials & Methods Transfer
Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3M paper 2개, PVDF 1장 (조 이름 기입), 핀셋 Cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한다 (Gel이 찢어지지 않도록 조심) -> tray로 옮긴다 PVDF를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다 Transfer cassette - sponge - 3M paper - membrane – Gel - 3M paper sponge 순서로 쌓는다 Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100V로 1시간 transfer 5% skim milk in TBS-T 용액에 1시간 incubation

13 Report 12/7 5시 까지 제출