HLA 검사 진단검사의학과 김 명 희.

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1 HLA 검사 진단검사의학과 김 명 희

2 Introduction MHC(Major Histocompatibility Complex)
Highly polymorphic genes Recognition by T lymphocytes MHC molecules display antigenic peptides to T cells HLA(Human Leukocyte Antigen) Human MHC 면역성이 강해 타인에게 이식될 경우 강한 면역 반응 유도 HLA 유전자 Class I: HLA-A, -B, -C Class II: HLA-DR, -DQ, -DP

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4 * HLA 적합한 형제 공여자 선택하는 것이 중요
이식관련 면역검사 공여장기의 종류 신장 췌장 BM 심장 간장 생존가족 사체 ABO 혈액형 ++ HLA-A, B +* 비적용 ++* HLA-DR + HLA crossmatch MLC * HLA 적합한 형제 공여자 선택하는 것이 중요

5 Tissue/Organ Transplantation
HLA matching: HLA-A, -B, -DR Serologic level에서는 적합해도 allele level에서는 부적합한 경우가 있음. Hematopoietic progenitor cell transplantation HLA 유전자가 allele level에서 적합한 경우 rejection이나 GVHD 빈도가 낮고 이식 성적이 더 좋다. Solid organ transplantation KT에서 이식신 생존률이 HLA 일치도가 높을수록 더 높으나 면역억제제 등을 이용하여 면역 반응을 조절할 수 있으므로 HLA 일치하지 않는 상태에서도 이식 가능하다. LT에서 간은 HLA-DR을 많이 표현하지 않으므로 HLA가 일치하지 않아도 크게 거부반응이 문제되지 않는다.

6 HLA typing Serological method Cellular typing Molecular Analysis
Microcytotoxicity Cellular typing Mixed Lymphocyte Culture (MLC) Molecular Analysis PCR-SSP PCR-SSOP, Reverse SSOP PCR-SBT PCR-RFLP, PCR-RSCA, PCR-SSCP etc.

7 HLA typing – Serologic test
검사원리 보체의존성 세포독성검사 (complement-dependent cytotoxicity) microcytotoxicity test

8 HLA typing – Serologic test
- 현미경 판독 위상차현미경 X 100배 시야에서 판정한다 죽은 세포의 %에 의해 1+-8+의 score를 기록한다. % Dead Cells Score Interpretation % Negative % Doubtful negative % Weak positive % Positive % Strong positive

9 8 (strong positive, %) 6 (positive, 51-80%) 4 (weak positive, 21-50%) 1 (negative, 1-10%)

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11 HLA typing – DNA test 1. SSO (sequence-specific oligonucleotide) typing 2. Reverse-SSO (sequence-specific oligonucleotide) 3. PCR-RFLP typing 4. PCR-SSCP (Single-Stranded Conformation Polymorphism) 5. Direct sequencing 6. PCR-SSP (sequence-specific primers)

12 Sequence-Specific Oligonucleotide Hybridization

13 SSO probe

14 Reverse SSO HLA DNA typing

15 PCR-RFLP Multiple restriction endonuclease: PCR product 내의 특정 염기서열을 절단 → EP: DNA fragment의 band pattern 관찰

16 SSP (sequence-specific priming)
HLA-DR SSP typing 24 SSP PCR reaction

17 HLA high resolution typing(SBT)
각 locus specific PCR primer → polymorphism 갖는 부위의 DNA증폭 → sequencing primer 이용하여 sequencing 가장 정확한 고해상도 검사방법

18 HLA Crossmatch (교차시험) 환자 혈액 내에 공여자의 HLA 항원에 대한 항체가 존재하는지 검사 방법
(1) 보체의존성 세포독성검사 공여자 림프구 + 환자혈청 기본방법 - NIH법, 예민한 방법 – anti-human globulin (AHG) 방법 (2) 간접면역형광법 - 유세포분석기

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20 Cell isolation 1) Mononuclear cell isolation by density
2) Lymphocyte isolation 3) Subset purification – T-, B-lymphocyte isolation Nylon wool separation Immunomagnetic isolation using beads Augmentation with monoclonal antibody Rosetting with sheep RBC 각 cell들의 여러가지 차이점 Density, size, granularity, adherence, cell-surface marker phagocytic capability –을 이용하여 cell isolation을 시행 Immunomagnetic isolation using bead Leukocyte의 surface marker, surface immunoglobulin, specific recognition site를 이용하여 분리하는 방법 Lympho-KwikTM (One lambda, Inc.) Specific monoclonal antibody와 complement를 이용하여 non-lymphocytic cell을 lysis시킴 Lysed cell은 density centrifugation으로 분리 Test 목적에 맞게 5가지 Kit가 상품화되어 있음 Premixed cocktail of monoclonal antibodies, complement and a stable density gradient for lymphocyte Rosetting with sheep RBC Principle T cell 표면에 있는 sheep RBC (SRBCs)에 특이적인 receptor에 의해 rosette을 형성 CD2 – SRBC receptor Procedure 1mL lymphocyte suspension과 1mL 0.5% SRBC suspension을 혼합한 후 200g에서 5분간 centrifuge Cell pallet을 4℃에서 18시간 incubation후 resuspension Separation of E-rosette positive and E-rosette negative cells Density gradient centrifugation – use FH solution E-rosette T-cell 분리 NH4Cl로 RBC를 lysis

21 Mononuclear cell isolation
Ficoll-Hypaque (FH) separation Percoll separation High molecular sucrose polymer로 blood 점도를 높이며 적혈구의 molecular formation을 촉진

22 Method – Nylon wool separation
T-cell 분리 – warm(37℃, 8mL) 5% HIFCS washing, 2회 B-cell 분리 – iced 1.5mL HIFCS  squeezing, 5번 반복

23 판독 T 림프구 교차시험 양성 B 림프구 교차시험 양성 : HLA-A, B, C (class I)에 대한 항체가 있다는 의미
초급성거부반응과 관계되므로 이식의 금기 B 림프구 교차시험 양성 : HLA class II 항체, 약한 class I 항체, : 절대적 금기는 아니나, 높은 역가 (1:8 이상)인 경우 이식성적 저하.

24 FCM HLA X-match 검사원리 Indirect cross-match technique
Direct XM: CDC Indirect immunoflourescence Donor cell과 patient's serum을 incubation하여 binding 단계를 거친 후, FITC-conjugated anti-human IgG를 첨가하여 target cell에 반응된 patient's Ab를 detection Flow cytometry로 그 정도를 측정하여 항체의 유,무를 판정 낮은 농도의 Ab까지도 측정이 가능하다

25 CD3 monoclonal with fluorochrome conjugates
Fluoresceinated (FITC) goat: anti-human polyclonal immunoglobulin Most widely used reagent Phycoerythrin (PE) Perdinin chlorophyll protein (PerCP) CD3 monoclonal with fluorochrome conjugates Specifically detect T cell reactivity CD19 or CD20 monoclonal with fluorochrome conjugates Specifically detect B cell reactivity Multi-color method NK cell, monocyte에 의한 background binding을 없앨 수 있음 2-color ; PE conjugated CD3 or CD20 3-color ; PE conjugated CD20 and PerCP conjugated CD3

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27 What crossmatch technique were used?
CDC Flowcytometry 장점 Complement activation을 일으키는 antibody를 직접 확인 결과 정량화 가능 Cell 분리가 특별히 필요 없음 Alloantibody의 isotype 식별가능 민감도와 특이도가 높음 단점 민감도와 특이도가 높지 않음 살아있는 cell이 필요 시간, 노력이 드는 검사 실제 문제가 되지 않는 case에서도 양성 반응을 보일 수 있음

28 PRA (panel reactive antibody)
(1) 방법 - 보체의존성 세포독성검사 - HLA 항원을 아는 수십명 (30-60명)의 림프구로 구성된 panel을 이용하여 HLA 항체를 검사 - 양성 여부와 양성인 경우 림프구 panel 중 몇 %에 반응하는가(%PRA)와 HLA 항체 특이성을 판정하여 보고

29 PRA (panel reactive antibody)
(2) 목적 환자에서 HLA 항원에 감작된 정도(% PRA)를 파악 -> 교차시험 적합 공여자를 만날 수 있는 가능성 및 장기이식 대기시간 예측 - HLA 항체 특이성 동정 -> 공여자 선정시 피해야 하는 HLA 항원을 알 수 있어 불필요한 교차시험 방지 - 혈소판불응증 환자 : HLA적합혈소판 수혈