Y chromosome and Multiplex PCR

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1 Y chromosome and Multiplex PCR
분자 생물 계통 분류학 실험실 석사 1년차 신 경미

2 Y chromosome 연구의 변천사 1976년--Tiepolo and Zuffardi가 azoospermia를 가진 6명의 환자가 Yq 커다란 deletion을 보고하면서 spermatogenesis에서의 Y chromosome의 역할을 제시함. ( 이 발견은 spermatogenesis동안에 작용하는 유전자의 하나가 Yq영역에 위치함을 지시함) 1991년-- Mikio Namiki 는 불임 환자 clinic에서 azoospermia를 가진 남성을 평가한 결과 그들 중 17%가 염색체 이상을 가졌음(그들 중 어떤이는 클라인펠터 증후군을 가졌고 다른 이들은 Yq 커다란 deletion을 나타냄-- azoospermia가 Yq 커다란 deletion을 가짐을 다시 지지함) 1992년-- Foote and coworkers은 human Y chromosome의 완벽한 physical map을 완성함 (이것은 Y-specific sequence-tagged site[STS]를 이용할 수 있게 됨.) 1993년-- Ma and coworkers는 Y chromosome cosmid library로부터 AZF candidate sequences를 동정하였는데 이것은 특별하게 testis에서만 발현이됨 (이 유전자를 YPRM1 and YPRM2[Y chromosome RNA recognition motif를 의미하는데 그 이유는 이 두개의 translation이 RNA recognition motif를 포함하는 RNA-binding protein superfamily와 homology를 들어내기 때문임--지금은 RBM1 & RBM2라 부름.) 1995년-- Reijio and coworkers는 새로운 AZF 유전자를 DAZ[deleted in azoospermia]로 보고함. (이들은 PCR방법을 사용해서 87명의 azoospermia 환자의 DNA를 분석한 후에 그들 중 12명이 DAZ유전자의 결실을 보임을 증명함.--흥미롭게도 DAZ proteins은 RNA-binding protein과 유사성을 지님을 보임. RBM과 비슷하게 DAZ는 특별하게 testis에서 발현되고 human에서 single gene으로 간주됨.) 1996년– Vogt and coworkers는 AZF를 AZFa,AZFb,AZFc라는 세개의 지역으로 나눔. AZFa candidate gene-- not yet known AZFb candidate gene-- RBM gene family. AZFc candidate gene-- DAZ, SPGY1 AZFc candidate gene-- DAZ, SPGY1 두 유전자는 testis specific RNA binding proteins을 code하여 family relationship을 제시함. 1. DAZ는 72 nucleotide unit 로 구성된 7개의 tandem repeats를 포함. 2. SPGY1은 DAZ 반복 서열처럼 똑같은 consensus sequence를 가진 72 nucleotide unit 로 구성된 최소 12개의 tandem repeats를 포함.(DAZ, SPGY1 specific primer pairs를 사용하면 둘 다는 AZFc region에 map되어지고, 모든 AZFc환자에서는 완전히 제거된 것을 볼수 있음.

3 Causes of male infertility
Spermatogenic disorder Idiopathic, Varicocele, Undescended testis, Chromosomal abnormality Endocrinologic abnormality (ex.hyperprolactinemia,hypogonadotropic hypogonadism) Others Obstruction of the seminal tract Congenital, Inflammatory, Iatrogenic Inflammation Sexual disorder Erecticle disorder, Ejaculatory failure

4 PCR과 multiplex PCR의 차이점 비교
1. Composition의 차이 multiplex PCR의 조성 PCR의 조성 500 nanograms of genomic DNA a mixture of 10 mM Tris–HCl (pH 8.3), 50mM KCl , 1.5 mM MgCl2 0.4 mM each dNTP, 5 IU of Ampli Taq Gold DNA polymerase, 0.8μM concentration of each primer redistilled H2O to a final volume of 50㎕ genomic DNA a mixture of 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 100mM NaCl , 15 mM MgCl2 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% glycerol 2.5 mM each dNTP, 5 IU of Ampli Taq Gold DNA poly-merase, 0.8μM concentration of each primer redistilled H2O to a final volume of 50㎕ 2. Cycle의 차이 95C for 10 min 94C for 45 sec (denaturation) 60C for 1 min (annealing) 72C for 2 min (extension) 72C for 7 min (final extension) 100 V for 90 min 94C for 4 min 95C for 30 sec (denaturation) 40~60C for 30 sec (annealing) 72C for 40 sec (extension) 72C for 7 min (final extension) 100 V~200 V for 5~20 min 45cycle 30cycle 3. Primer차이 – 그림1 & 그림2 참조 4. Taq polymerase 차이 – mispriming과 primer oligomerization으로 생길수 있는 nonspecific PCR product 발생의 감소를 위해 Ampli Taq Gold DNA polymerase사용. (그림3 참조) 5. dNTP차이 -- 4번 이상의 해동은 Multiplex PCR에서는 불리. (그림4. 참조)

5 A A B B 그림3. Ampli Taq Gold DNA polymerase와
standard Taq polymerase의 비교. 그림1. 각각의 multiplex PCR set에서 적절한 5번째 primer 찾기 A A B 4번 이상 해동한 dNTP tkdyd B 그림 primer set 를 사용한 multiplex PCR ( Sample : 두명의 oligozoospermic men) 그림4. 신선한 dNTP의 사용비교.

6 References 1. Multiplex PCR for Screening of Microdeletions on the Y chromosme. Journal of Assisted Reprodution and Genetics (2001) 2. Genetic Aspects of Male Infertility. World journal of Surgery (2000) 3. Human Y chromosome azoospermia factors(AZF) mapped to different subregions in Yq11. Human Molecular Genetics (1996) 4. The human Y chromosome : function, evolution and disease. Forensic Science International (2001)