Western Blot.

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1 Western Blot

2 SDS-PAGE gel Comb 여기에 정량한 단백질 넣음 Stacking gel Separating gel

3 SDS-PAGE gel ＊SDS-PAGE gel의 조성 및 역할 ＊ SDS-PAGE gel의 조성들의 역할
1> Stacking gel: 30% Acrylamide, 1.0M Tris-HCl(pH6.8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW. ☞ 단백질을 한번에 동시에 출발하게 하기 위해서 2> Separating gel: 30% Acrylamide, 1.5M Tris-HCl(pH8.8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW. ☞ 단백질이 크기별로 분리되기 시작하는 곳으로써 Seperating gel의 acrylamide 농도가 높을수록 더 작은 크기의 단백질을 분리할 수 있다. ＊ SDS-PAGE gel의 조성들의 역할 1> Acrylamide(4℃보관): gel의 중합체를 형성해준다. 2> SDS: 단백질들을 음전하로 만들어 준다.(즉, denaturation시킴.) 3> APS(4℃보관): Gel을 굳게 해주는 역할을 한다. 4> TEMED: APS 촉매제로써 gel을 빨리 굳게 해준다. 5> Isopropanol: seperating gel과 stacking gel의 경계면을 평평하게 만들어 준다.

4 Sample buffer 단백질을 변성시켜주는 요소들이 들어있는 혼합물임. ＊ Sample buffer의 조성
- 25% glycerol (25%), 2% SDS, 60m M Tris-Hcl(pH 6.8) ,5% 2-mercaptoethanol ,0.1% BPB(Bromophenolblue) ,DW. ＊ Sample buffer의 조성들의 역할 1> Glycerol: well에 단백질 혼합물이 잘 들어가게 해준다. 2> SDS: 단백질들을 음전하로 만들어 준다. 3> 2-mercaptoethanol: 이황화 결합을 끊어 준다. 4> BPB(Bromophenolblue): indicator역할을 한다.

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7 실험 재료 - Pipette, tip, gel cassette, hand towal, 50ml conical tube, 15ml conical tube, 30% Acrylamide, 1.5M Tris-HCl(pH8.8), 0.5M Tris-HCl(pH6.8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW, isopropanol, comb, timer, 1.7ml epp.tube, 4X Sample buffer, vortex, heat block, 5% skim milk, sponge, gel cassette, paper, buffer, methanol, ice, membrane 등

8 실험방법 ＊ SDS-PAGE gel 만들기 1> Target 단백질의 크기는 약 54kDa이다. 따라서 10% gel을 만들 것이다. 2> gel cassette를 실험대에 고정시킨다. 3> 10% Separating gel mixture를 만들어 Vortex한 후, 1ml pipette을 이용하여 gel을 2/3 넣는다. 4> Separating gel의 표면을 평평하게 만들기 위해 1ml의 isopropanol을 넣는다. 4> 20분간 separating gel을 굳힌다. 5> Separating gel이 다 굳었으면 5% stacking gel mixture을 만들어 vortex한 후, 1ml pipette을 이용하여 gel을 1/3 넣는다. 6> Comb를 끼고 10분 stacking gel을 굳힌다.

9 실험방법 ＊ 단백질 sample 만들고, SDS-PAGE gel 내리기
1> 정량한 단백질 sample+ Lysis buffer+ 4X Sample buffer을 넣어 만든다. 2> 95℃, 5분간 boiling. ☞ 단백질의 folding을 풀어주는 역할, 즉 단백질을 변성시킨다. 3> 미리 만들어 둔 gel이 굳은 것이 확인되면, 전기영동 장치에 running buffer를 채워준 후 변성된 단백질 sample과 marker를 함께 gel에 loading 한다. 4> Stacking gel을 지나는 동안 90V로 내려주고, separating gel에서는 120V로 바꿔준다. 5> 단백질이 gel 끝부분까지 내려오면 바로 다음 단계에 진행 할 transfer를 위한 준비를 한다.

10 실험방법 ＊ 단백질 transfer 하고, antibody 붙이기
1> transfer cassette에 순서대로 sponge-paper-gel-membrane-paper-sponge 순으로 깔고 닫는다. 2> 100V, 1hr 동안 transfer 한다. 3> transfer가 잘 되었는지 확인 후, 5% skim milk로 1hr 동안 blocking 한다. 4> TBST buffer로 가볍게 wash후, 1st antibody를 overnight하여 붙인다. 5> TBST buffer로 10min씩 3번 wash후, 2nd antibody를 50min동안 붙인다. 6> TBST buffer로 10min씩 3번 wash후, exposure한다.