Alkaline phosphate Stain Sudan Black B Stain

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1 Alkaline phosphate Stain Sudan Black B Stain
Peroxidase Stain Alkaline phosphate Stain Sudan Black B Stain 2-B반 6조 김선영 이규호 황정인

2 Special stain 세포 중 포함되어 있는 특정의 효소나 어떤 특정 물질과 화학반응을 이용하여 염색하는 것
최근에는 세포화학적반응 ( cytochemastry reaction ) 검사라 부름 염색되는 물질명, 염색에 이용되는 시약명을 검사명으로 함 Wright stain만으로 세포의 분류가 어려운 경우에 유용 하므로 미성 숙 세포를 대상으로 함

3 Peroxidase stain

4 Peroxidase stain 목 적 골수계 세포중의 과립구와 단구의 Lysosome에 있는
enzyme으로서 이것을 myelo-peroxidase라고 함. Perocidase반응은 급성백혈병이 과립구 계열인지, 비과립구 계열진지를 구별하여 진단하기 위함 원 리 효소의 염색에는 그 효소의 기질이 포함되어 있는 반응액과 반응시켜 발색시킴                              peroxidase 기질(AH)  +  H2O > 기질의 산화물(발색)                                  ox  2AH  + 1/2 O₂     >   2A  +  H2O

5 Peroxidase stain 철을 함유한 peroxidase는 골수계 세포의 일차(azure) 과립
속에 국재하는 것으로 인식됨 그 활성은 발색 물질과 H2O를 이용하여 증명할 수 있다. ㅡperoxide-peroxidase계는 무색의 peroxidase지시 물질 (S)을 다음 화학식으로 표현한 것과 같은 반응계로 신속히 산화하여 발색 시킴

6 Peroxidase stain Peroxidase 의 증명 - Amino carbazole - Phenol 및 naphthol
- Benzidine 및 그 유도체(예:O-toluidine) - Amino carbazole - Phenol 및 naphthol - FDA와 같은 다수의 물질 < Peroxidase 염색 기질 >   - benzidine 혹은 그 유도체, fluorine 유도체, naphthol 유도체, carbazole 유도체 등이 이용되고 있음 - 이 중 benzidine은 가장 오래 전부터 사용되어 왔지만 발암성 있어 발매가 금지됨 그러나, 그 유도체인 Diaminobenzidine(DAB)는 사용되고 있음

7 Peroxidase stain 검체의 종류 시약 및 기구 Formalin 1 part 95%ethanol 9 part
혈액 도말 slide 시약 및 기구 1. 고정액: 10%formalin-ethanol Formalin part 95%ethanol part 2. 염색시약 O-toluidine mg Absolute ethanol ml D.W ml → 혼합한 후, 3% H2O₂20㎕ 를 넣어 세게 혼합하고 filter함

8 Peroxidase stain 3. Hematoxylin stain sol. 4. Chemical balance
5. Beaker 6. Pipette 7. Automatic pipette & tip 8. Filter paper 9. Forceps 10. Cover slip 11. Slide 걸이 12. 유리용 다이아몬드 연필 13. 스톱워치

9 Peroxidase stain 과 정 염색할 slide에 10%formalin-ethanol을 얹고 30초 동안 고정
2. Tap water로 수세 3. 공기 중에서 건조 4. 미리 만들어 놓은 염색액을 slide위에 얹고 7분 5. Tap water로 수세 (이때 milky하게 씻김) 6. 공기중에 건조 7. Wright stain→ 수세→ 건조→ 봉입→ 검경

10 Peroxidase stain 결 과 *양성: Yellow에서 Brown까지의 색깔을 띈 과립 - 양성
과립구(neutrophil, eosiniphil, basophil) : strong (+)   monocyte : neutrophil보다 약한 (+) Auer body Myelocyte - 음성 림프계 적아구계 Myeloblast : 골수아구와 단아구와 같이 아주 미숙한 세포

11 Peroxidase stain 정도 관리 * 검체 취급방법 검체는 formalin에 오염되지 않은 도말 slide이어야 함
① Heparin 등 항응고제가 섞인 혈액으로 도말한 경우 ② 너무 희석된 검체로 만든 slide 3. Slide를 잘 말리고 난 후, 고정액으로 고정한다. 4. 보관 시에는 빛을 차단하여 건조하게 냉장 보관한다. 5. 검체 slide내의 중성구의 염색상태로 염색의 질을 판단할 수 있다.

12 Peroxidase stain Peroxidase 염색강도 계통 세포 강도 과립구계 골수아구 호중구계 (전골수구 분엽핵구)
호산구계 호염구계 ~ + +~++ ++~+++ + 단구계 단아구 단구 ~ ± ± ~ + 기타 림프구 형질세포 거핵구 혈소판 - -: 음성, ±: 약양성, +: 양성, ++~+++: 강양성

13 Peroxidase stain 임상적 의의
염색소견은 백혈병세포의 경우에도 거의 적용되지만 특히 급성백혈병의 형태 분류에 매우 중요하다. FBA 분류에서 골수표본의 아구(핵의 형태나 크로마틴 망공에서 미숙이라고 판정된 세포)의 양성율이 3% 이하인 경우를 급성 림프성백혈병(ALL), 3% 이상인 경우를 급성골수성(AML)이라고 진단 이 3%라는 숫자는 ALL 환자의 골수에도 정상적인 골수아구나 전골 수구가 약간은 잔존한다는 의미로서 일단 3%로 규정해 놓은 것이다. 한편  AML의 골수아구 또는 단아구에도 최대 97%까지는 음성으로 나타날 수 있다는 것이 된다. 그러나 AML 중에도 M5의 일부와 M7에서는 양성율이 3% 이하이다. ALL과 AML은 치료법이 다르므로 본 염색의 의의는 매우 크다

14 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> 원 리 2,7-fluorenediamine(FDA)을 반응기질로 하고 H2O2를 가하여 peroxidase를 반응시키면, fluorene blue로 됨 (이 fluorene blue는 다시 중합되어 fluorene brown이 되기도 함)

15 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> 시 약 1. 고정액: 10% 황산동(CuSO4)수용액 2. 반응액 (최종 pH7.4) 2,7-diaminofluorene 100mg을 motar에 넣고, tris염산 완충액 (pH9.0) 100ml를 더하면서 잘 갈아 부순다. 이 용액은 과포화용액이기 때문에 백탁, 침전물이 생기 므로 사용할 때 잘 흔들어 혼합해서 사용한다. * Tris염산 완충액은 Tris 24.3g을 D.W 1000ml에 녹인 것을 250ml취하여 다시 D.W 1000ml로 희석한 것으로 pH는 1N HCl을 사용하여 조정한다. (예: pH 7.6->HCl 40ml)

16 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> 3. 1% safranine O 수용액: 후 염색 4. 3% H2O2 5. 20% aluminum sulfate 수용액

17 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> 과 정 1. 도말 건조표본을 고정액으로 5초간 고정한다. 2. 흐르는 물로 수세한다. 3. 반응 혼합액을 사용시 조제한다. 즉, 2액 3ml, 3액 약 6ml에 4액을 한 방울 떨어뜨려 잘 혼합한 후 5액을 반응 직전에 2~3방울 떨어뜨려 만든다. 이 반응 혼합액에서 7~10분간 반응시킨다. (3액은 후 염색액이므로 빼고 반응시킨 후 염색시켜도 좋다) 4. 흐르는 물로 수세하고, 공기 건조시켜 검경한다.

18 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> 결 과 Peroxidase 양성 세포는 선명한 청색조의 과립상으로 염색 해 석 림프구, 거핵구 및 적혈구계의 세포 : myeloperoxidase(-) 단구 : 일반적으로 (-)이나 약 양성(±) 보이는 것도 있음 Myeloblast를 제외한 모든 골수계 세포 : (+)

19 <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법>
Peroxidase stain <FDA를 쓰는 peroxidase염색 개량법> myeloperoxidase(+)과립은 편광 광선 하에서는 이중굴절성을 나타낸다. Lymphoblast(-),myeloblast는 때때로 (+)를 나타내기도 하므로 peroxidase(+)소견은 급성백혈병의 검토에 유용하다. 그러나 peroxidase반응이 (-)의 경우는 골수아구의 일부 타 단아구도 림프아구와 같이(-)일 수 있으므로 감별의 의의가 없다. Auer소체는(+)이다. Peroxidase 반응은 급성감염증의 호중구, 급, 만성 골수성 백혈병 및 그 밖의 골수 증식성 질환, 혈우병 및 급성 골수성 백혈병의 일부 증례에서는 음성을 나타낼 수가 있다.

20 Bone marrow smear, Peroxidase stain, x1000

21 Myeloperoxidase stain

22 Megakaryocyte, blasts, peroxidase stain, M-7 leukemia

23 Peroxidase stain, acute megakaryocytic leukemia

24 Peroxidase stain, promyelocytic leukemia

25 Peroxidase stain, Auer Rod+

26 Alkaline phosphate stain

27 Alkaline phosphate stain
목 적 Alkaline phosphatase는 주로 mature neutrophil의 cytoplasm 에 포함되어 있으며 이 효소의 활성은 각종 질병에 따라 증감한다. 원 리 기질(인산에스텔) ───────→ Naphthol + 인산 Naphthol + Diazonium salt ──────→ Azo dye 기질로서 naphthol AS-MX phosphate는 ALP와 반응, 가수 분해에 의해 naphthol을 생성하고 naphthol은 diazonium salt 인 fast blue RR과 반응하여 청색의 azo색소를 발색시킴 이것을 azo 색소법이라 한다. 양성 호중구는 청색과립을 나타내지만 양성의 정도를 4단계 or 5단계로 나누어 score를 산출, 반 정량적으로 표현한다.

28 Alkaline phosphate stain
과 정 ① 신선한 혈액 또는 heparin 혈액을 사용하여 도말표본 작성 (EDTA혈액은 사용하지 않는다.) ② 0~5℃ formalin-methanol 고정액 속에 정 확히 30초간 침적 또는 실온에서 citrate 완 충 acetone속에 정확히 30초간 침적 ③ 흐르는 물로 30~60초간 세척하고 건조 ④ 실온에서 정확히 60분간 사용시 제조한 신선 한 기질액 속에 침적 ⑤ 흐르는 물로 30~60초간 세척 ⑥ 5~10분간 hematoxylin으로 후염색 ⑦ 흐르는 물로 30~60초간 세척 ⑧ 희석 암모니아수 속에 한번 넣었다 꺼내 푸른 색으로 발색시킴. ⑨ 흐르는 물로 5~10분간 세척 ⑩ 건조시킨 후 glycerin-gelatin으로 봉입, 검경 → 장기보전시 색소 퇴색

29 Alkaline phosphate stain
판 정 성숙 호중구의 양성도를 5형으로 분류한다. 적어도 100개의 성숙 호중구를 관찰하고 LAP의 활성도를 다음과 같이 표현 한다. - Ⅰ : 0 score : 세포질이 무색 (청색의 과립이 없음) - Ⅱ : : 세포질은 청색, 과립은 보이지 않음 - Ⅲ : : 세포질은 청색, 때로는 자색의 과립이 보임 - Ⅳ : : 중등도의 청색 과립이 보임 - Ⅴ : : 다수의 진한 청색 과립 ※ 양성률 : 양성 호중구 ( Ⅰ- Ⅴ형)의 백분율 % ※ 양성지수(score) : 100개의 호중구에 대하여 각형의 호중구 수와 그 점수의 누적량을 총화

30 Alkaline phosphate stain
정상치 LAP는 성, 연령, 임신에 따라서 다르다. 성인 양성률 : 남성 ▶ 85 ± 9%, 여성 ▶ 89 ± 8 % 10세 이하에서 높고 70세 이상에서는 저하된다. 임신하면 임신 개월 수와 함께 높아진다 임상적 의의 낮은 수치를 나타내는 병 만성 골수성 백혈병 : 만성기에는 약간의 예외를 제외하고 현저하게 낮은 수치를 나타낸다. 급성전환기에는 상승 경향을 나타낸다. - 발작성야간혈색소뇨증(PNH) , 급성 골수성 백혈병 - 전염성 단핵구증 초기, 교원병, 적백혈병, 유전성저인산효소증

31 Alkaline phosphate stain
높은 수치를 나타내는 병 - 유백혈병반응(중증세균감염증이나 암 등) 대부분의 예에서 높은 수치를 나타내고 만성골수성 배혈병과의 유력한 감별법이 된다. 골수 증식 증후군, 재생 불량성빈혈, 급성림프성백혈병 Hodgkin’ disease, 조직의 괴사, Infectiousleukocytosis - 임신 및 수유기, 스트레스, 경구피임약 복용

32 Alkaline phosphate stain

33 Alkaline phosphate stain

34 Alkaline phosphate stain

35 Alkaline phosphate stain

36 Alkaline phosphate stain

37 Alkaline phosphate stain
Neutrophilic alkaline Phosphatase Stain - 4+

38 Alkaline phosphate stain
Neutrophilic alkaline Phosphatase Stain - 2+

39 Sudan Black B stain

40 Sudan Black B stain 목 적 Acute Granulocytic leukemia,
- SBB는 중성지방, 인지질, sterol 등과 같은 세포내 지질과 반응하고, 다형호중구와 단구 과립에 대한 친화성을 가짐 일반적으로, SBB에 양성으로 염색되는 반응의 강도 myeloperoxidase 활성과 비례함 목 적 - 백혈병의 감별진단 Acute Granulocytic leukemia, Acute monocytic leukemia, Acute lymphocytic leukemia를 감별하는데 이용한다.

41 Sudan Black B stain 원 리 ※ lipid 검경 Oil red O ⇒ 조직학에서 많이 이용하는 방법
주로 granulocytes에 포함되어 있는 neutral fat, phospholipid, sterol과 같은 종류의 lipid가 있는 곳에 지질색소가 녹아 들어가서 물리화학적 기전으로 염색을 하여 백혈구의 종류를 구별. (Black color) ※ lipid 검경 Oil red O ⇒ 조직학에서 많이 이용하는 방법 주로 중성지방 검출. Sudan black B ⇒ 혈액학에서 많이 이용하는 방법 주로 인지질 검출

42 Sudan Black B stain 시약 및 기구 <시약> ① working solution
sudan black B stock solution ㎖ buffer solution ㎖ ② wright's stain ③ formal alcohol ④ 70% ethanol ⑤ D.W <기구> ① 현미경 ② stain jar ③ 스포이드

43 Sudan Black B stain 과 정 결 과 ① 공기 건조시킨 혈액도말 표본 또는 골수표본을 formal alcohol로
5분간 고정한다. ② 흐르는 수돗물로 10분간 수세한다. ③ working solution에 표본을 담궈 30분간 염색한다. ④ 70% ethanol로 2～3분간 씻는다. ⑤ 2분 동안 수돗물로 수세한다. ⑥ wright stain으로 counter stain한다. ⑦ 검경한다. 결 과 - Positive : Auer body, granulocyte - Partical positive : Monocyte - Negative : Lymphocyte, Megakaryocyte, Platelets

44 Sudan Black B stain

45 Sudan Black B stain 세포 종류 반 응 호중구와 이들의 전구세포 양성, 성숙세포일수록 반응이 강하다.
세포 종류 반 응 호중구와 이들의 전구세포 양성, 성숙세포일수록 반응이 강하다. 골수아세포 (Myeloblast) 음성이거나 때로 약한 양성반응을 보인다. 골수아세포의 종류에 따라 양성이 다르다. 골수아세포 1형 : 음성반응 골수아세포 2형 : 약한 양성반응 또는 음성 골수아세포 3형 : 강한 양성 Auer rod 양성 호산구 과립의 중앙은 음성이며 가장자리가 양성 호염기구 다양한 반응 단구 세포전체에 미세한 과립으로 양성 임파구 음성 적혈구 전구세포 거핵아구(Megakaryocyte)와 혈소판 대부분 음성

46 Sudan Black B stain 세포 염색성 골수아구 ± 전적아구 - 전골수구 + ~ +++ 염기성적아구 골수구
다염성적아구 후골수구 망상적아구 간상구 적혈구 다핵호중구 거핵구 호산구 혈소판 호염기구 - ~+ 림프구 - ~ ± 단구

47 Sudan Black B stain 참 고 ① sudanphilia와 peroxidase과립은 밀접한 관계가 있다.
② acute granulocytic leukemia과 Acute lymphoytic leukemia 진단에 임상적 의의가 있다. ③ Counter stain은 Hematoxylin을 사용해도 좋다. ④ lipid dye와 lipid용매는 다음조건을 구비해야 한다. lipid dye lipid용매 색채가 강하다 lipid를 용해시키지 않는다 lipid에 잘 용해된다 lipid dye를 완전히 용해시킨다 lipid이외의 세포내 성분에는 친화성 없다 lipid와 용매와의 분배계수가 몹시 크다

48 Sudan Black B stain 참 고 1. 과립구계 세포는 성숙함에 따라 sudan호성이 증대한다.
극히 소량의 양성과립을 핵주변에서 발견하는 일이 있다. 전골수구부터 양성이 되는데, 전골수구에서는 양성과립이 세포질의 일부에 제한되어 있다. 호중성 골수구, 후골수구, 간상핵구, 분엽핵구가 되는것에  따라 과립은 농후하고 조대하며, 밀도도 높아진다. 더욱 성숙한 세포에서는 세포질에 가득하여 핵의 일부를 덮을 정도가 된다. 이들 과립은 호중구성 특이과립과 일치한다. 호산성 과립은 주변부가 양성으로 염색되나, 호염기성 과립은 여러 가지 반응을 보여, 어떤 것은 음성으로, 또 어떤 것은 양성으로 염색된다.

49 Sudan Black B stain 2. Lymphocyte는 Sudan black B 음성이고,
대부분의 단구는 따로따로  떨어진 양성과립이 산재하는 것이 보이지만 아주 일부의 것은 완전히 음성이다. 3. 거핵구, 적아구, 정적아구 및 혈소판은 sudan black B 음성이다. 4. 급성 골수아구성 백혈병의 대다수의 증례에서는 백혈구성의 골수아구가 정상에서 보다 성숙한 형의 과립구계 세포로 보여지는 듯한 과립상의 sudan호성이 보인다. 백혈병성 골수아구에서 보여지는 sudan호성은 아마도 핵-세포분화 의 해리를 시사하는 것으로 생각되어지며, Romanowsky염색만으로 는 명백하게 구별할 수 없는 골수아구들의 감별에 유익하다고 생각된다. 

50 Sudan Black B stain 5. 급성 단구성 백혈병이나 급성 골수 단구성 백혈병에서 보여지는
나타내는 일이 있다. 6. Auer body소체는 Sudan black B양성을 나타내며 적백혈병에서의 적아구는 Sudan black B음성이다. 7. 일반적으로 Sudan black B염색의 pattern은 myeloperoxidase의 존재 pattern과 유사함을 보인다. 8. 일반적으로 지질 염료는 색체가 강하고, 지질에 잘 용해되며, 지질 외의 세포성분에는 친화성이 없는 것으로써 SBB, Sudan Ⅲ, scha-rlach red가 있다. 또한 이 지질염료의 용매는 지질을 용해시키지 않으면서 염료만을 완전 용해시키는 것으로써 지질과 용매와의 분배계수가 큰 것일 수록 좋은데, 주로 55~70%의 ethanol이나 50% diacetate용액이 사용된다.

51 Sudan Black B stain AML : M1 : 아구의 3% 이상에서 양성을 보임
단구계의 단아구나 전단아구,            단구의 양자가 혼재하여 양성 내지 음성을 보임        M5 : monoblast, promonocyte, monocyte의 단구계 세포가 80% 이상 나타나면서 양성 내지 음성을 보임        M6 : 적아구계가 30~50% 차지하여 음성을 보임        M7 : 거핵아구 30% 이상 함유하면서 음성을 보임 CML : (+) ALL : (-) CLL : (-)

52 Sudan Black B stain 이 사진은 monocyte로 호중구보다 약양성 반응을 보인 모습이다.

53 Sudan Black B stain 과립구계 또는 monocyte의 염색 모습

54 Sudan Black B stain Blasts 안의 Auer rods와 강한 양성 반응을 보이는 metamyelocytes, 과립구계의 염색 양상

55 Sudan Black B stain Cytoplasm의 강한 양성 반응의 염색 모습