Mammalian cell culture Ⅰ

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1 Mammalian cell culture Ⅰ

2 실험 목적 Cell culture 세포배양의 기본인 계대배양을 단계별로 숙지하고 직접 실험을 진행하면서 각 단계의 주의할 점을 알아본다. 세포의 수를 대략적으로 계산하여 실험에 이용하는 방법을 숙지하고 직접 실험하면서 주의할 점을 알아본다.

3 Introduction Mammalian cell culture 계대배양
동물세포 배양이란 체외(in vitro)에서 인공적으로 체내(in vivo)와 유사한 조건을 제공하여 세포를 대량 증식시키는 방법이다. 이때 동물세포는 현탁(suspension)상태나 단층부착(monolayer-attachment) 상태로 생장한다. ● 세포주 배양(cell line culture) ● 초대 배양(primary cell culture)

4 Introduction 계대배양 (subculture) 계대배양
계대배양이란 동물세포를 대량으로 증식시키거나 세포의 대를 이어가기 위해서 dish와 배지를 옮겨주는 배양방식이다. 세포가 dish에 꽉 차기 전에 계대배양하는 것이 좋으며, 세포 종류에 따라 그 방법에 차이가 있다.

5 Introduction Cell seeding Cell seeding
세포를 실험에 이용하기 위해서 같은 양으로 분주하는 것이 cell seeding이다. 세포실험은 같은 양으로 분주하는 것이 중요하기 때문에 cell counting을 통해 정확히 나누어 분주한다.

6 Introduction Drug treatment Treatment
약물의 효능을 알아보기 위해서 세포를 이용하여 in vitro 실험을 진행한다. 비교를 위해서 대조군과 약물 처리군으로 나누어서 실험한다.

7 Introduction Cell line : AML-12 Chemical reagent : WY14643

8 액체질소에 동결보존 되어있는 cell을 증식시키기 위해 seeding
10/23 AML-12 stock seeding 액체질소에 동결보존 되어있는 cell을 증식시키기 위해 seeding 10/23 subculture cell을 증식시키기 위해 계대배양

9 증식 시킨 cell을 모아 hemocytometer로 counting하여 60π dish에 원하는 cell양을 seeding
10/26 seeding 증식 시킨 cell을 모아 hemocytometer로 counting하여 60π dish에 원하는 cell양을 seeding *모든 dish에 같은 양의 cell이 들어가는 것이 중요! AML-12 8*10^5cells/3ml 10/27 Drug Treat 하나의 dish에는 Control, 나머지 하나에는 Drug을 처리. 필요한 DMSO 농도와 drug 농도 계산을 먼저 하고 처리. Stock:10mM Control WY14643 0.1%FBS Media 2997μl WY 0μl 3μl DMSO(Vehicle) WY control 10μM

10 Control과 Drug에서의 RNA 발현 정도 비교
24h later RNA extract RNA 추출 11/3 cDNA 합성 추출한 RNA를 cDNA로 합성 11/10 Real-Time PCR Control과 Drug에서의 RNA 발현 정도 비교

11 Materials & Methods Cell seeding
배양할 세포, 배지, PBS, FBS, Antibiotics, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Hemocytometer, Tryphan blue, Incubator, Centrifuge 1. 기존의 배지를 제거하고 PBS 1 ml을 조심스럽게 넣고 가볍게 흔들어준다. 2. PBS를 제거한 후 Trypsin 0.5 ml을 넣고 Incubator에서 2분간 배양한다. 3. 배지 2.5 ml을 더한 후 Pipetting하여 15 ml tube로 옮긴다. 4. Room Temperature, 1000 rpm에서 5분간 centrifugation한다. 5. 조심스럽게 꺼내어 상층액을 제거하고 새로운 배지 1 ml을 넣어 재혼탁한다. 6. 세포 10ul + Tryphan blue 10 ul 를 섞어서 10 ul만 Hemocytometer에 분주한다. 7. Cell counting하여 원하는 세포 수 만큼 dish에 분주한다. 8. 잘 흔들어 준 후 현미경으로 관찰하고 Incubator에서 배양한다.

12 Treat Materials & Methods 배양할 세포, 배지, PBS, FBS, Antibiotics, Trypsin-EDTA, Water bath, Pipette, Tip, 15 ml tube, Incubator, Centrifuge, suction 1. 배지와 Drug를 농도에 맞게 혼합해준다. 2. Incubator에서 Plate를 꺼내 Cell을 현미경으로 관찰한다. 3. 기존의 배지를 suction으로 제거한다. 4. 1.번의 혼합액을 농도에 맞게 2ml씩 넣어준다. 5. 현미경으로 관찰 후 Incubator에 넣어 24h 배양한다.

13 Discussion Treatment Cell line : AML-12 Chemical reagent : WY14643
Q. 실험에 사용한 세포주와 약물에 대해 조사하시오 Cell line : AML-12 Chemical reagent : WY14643

14 Report 9+10주차 11/9 5시 까지 제출