Expression of protein 2주간 실험.

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1 Expression of protein 2주간 실험

2 실험일정 1주차 Protein purification 및 SDS-PAGE 만들기 2주차 SDS-PAGE

3 Theory : Protein Induction
- Non-metabolic inducer인 IPTG를 이용하여, protein을 과발현 시킬 수 있다. - 과발현된 protein은 purification을 통해, 정량하 여 enzyme reaction에 이용할 수 있다.

4 Theory : Purification of GST-fusion protein
GST는 glutathione-S-transferase의 약자로 glutathione에 강 한 affinity를 가짐 Glutathione이 immobilized되어 있는 sepharose bead를 이 용하면 GST와 glutathione간의 상호작용에 의해 GST가 fusion되어 있는 protein만 얻을 수 있다.

5 Method Ⅰ: Sample Preparation
Induction시킨 cell을 50ml tube에 넣고, 3200rpm에서 10분 동안 centrifuge를 진행한다. 상등액을 버린 후 GST binding buffer 6ml을 넣고 resuspend 한다. Sonicator를 이용해 cell을 깬다. 1.5ml tube 6개에 나눠 담은 후, 13000rpm에서 10분 동안 centrifuge를 진행한 다. 주사기로 상등액만 따서 filtering한다.

6 Method Ⅱ: Purification of GST-fusion protein
Column에 GST Binding Buffer 1ml를 첨가해 washing한다. → Column이 마르지 않도록 주의!! 준비한 sample을 1ml씩 첨가해 resin에 binding시킨다. GST Elution Buffer를 1ml 씩 첨가한다. 5-10방울 정도 버린 후, elute를 tube에 받는다(1ml만). GST Elution Buffer를 넣어 column을 washing 한다. 5를 반복.

7 Method Ⅲ : SDS-PAGE running gel 을 조성표를 참고하여 만든다
틀에 넣고 물을 1ml 넣은 후 30분간 굳힌다. 물을 흡습지를 이용하여 제거한 후 유리판에 comb를 살짝 넣는다. Stacking gel 을 조성표를 참고하여 만든다. Running gel 위로 stacking gel을 빠르게 넣는다 (금방 굳으므로 주의!) 15분간 gel을 굳힌다. Comb을 제거하여 만들어진 gel을 확인한다.

8 Method Ⅲ : SDS-PAGE Running Gel 10% 7% H2O 1665ul 2015ul
Acrylamide/Bis 1250ul 1000ul 1M Tris-HCl(pH 9.1) 2000ul 1900ul 10% SDS 50ul 10% AP 30ul TEMED 5ul Stacking Gel H2O 1775ul Acrylamide/Bis 390ul 1M Tris-HCl(pH 6.8) 750ul 10% SDS 30ul 10% AP 50ul TEMED 5ul Tank buffer Per liter Tris base 3g Glycine 14.4g 10% SDS 10ml

9 Theory : SDS-PAGE Ⅰ 원리 : Size(molecular weight)에 의한 분리
SDS-PAGE는 stacking gel(위)과 running gel(아래), 두 gel이 붙어있는 상태로 전기영동으로 시행 Sample을 loading하면 stacking gel에서는 sample이 빨리 내려가 모든 sample이 동시에 running gel이 시작되는 부분에서 같이 출발 → Running gel에서 protein의 크기에 따라 분 리

10 Theory : SDS-PAGE Ⅱ SDS (sodium dodecyl sulfate)
→ Strong anionic detergent로 protein이 (-) charge를 갖는 linear한 형태가 되게 한다. 2-mercaptoethanol → Disulfide bond를 풀어서 protein을 denaturing시킨 다. Coomassie Blue → Arg, Lys이나 aromatic ring이 있는 Tyr, Trp, Phe, His 등과 결합한다.

11 Method Ⅰ: SDS-PAGE <Sample>
Elution한 solution 10ul와 2X sample buffer 10ul를 tube에 넣고 잘 섞은 후, 5분간 끓인다. <SDS 내리기> 굳힌 gel을 전기영동 기구에 장치하고 tank buffer로 통을 채운다. Protein marker 5ul를 왼쪽 well에 loading한다. 나머지 well에 준비한 sample을 10ul씩 순서대로 loading한다. 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후, 100V의 전압을 가한다. Sample이 running gel의 끝까지 갈 때까지 전기영동을 실시한다. Sample이 다 내려가면, 전기영동 장치로부터 유리판을 꺼내 gel을 유리판에서 분리한다. 분리한 gel은 플라스틱 용기에 넣고 staining solution을 부어 염색이 충분히 되도록 약 30분간 서서히 흔든다. Staining solution을 버린 후, destaing solution을 부어 gel을 탈색시킨다.

12 Method Ⅱ: SDS-PAGE 2% Sample Buffer Staining Solution 100mM
Tris-HCl(pH 6.8) 4% SDS 20% Glycerol 200mM 2-mercaptomethanol 0.2% Bromophenol 0.1% Coomassie Blue R250 7% Acetic acid 40% Methanol Destaining Solution 40% Methanol 7% Acetic acid