제 3 주 발효미생물 유 재 수 교수.

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1 제 3 주 발효미생물 유 재 수 교수

2 미생물의 종류와 형태

3 미생물의 생육(증식) 방법 미 생 물 증 식 법 세 균 효 모 방선균 곰팡이 분열법(출아법) 출아법(분열법)
세 균 효 모 방선균 곰팡이 분열법(출아법) 출아법(분열법) 분열법, 균사의 신장

4 미생물의 생육 배지 원소 세균 (Luria, 1960 ; Herbert, 1976 ; Aiba et al., 1973) 효모
(건조 균체중의%) 원소 세균 (Luria, 1960 ; Herbert, 1976 ; Aiba et al., 1973) 효모 Aiba et al., 1973 ; Herbert, 1976) 곰팡이 (Lilly ; 탄  소 수  소 질  소 인 황 칼  륨 나트륨 칼  슘 마그네슘 염  소 철 50-53 7 12-15 0.5 45-50 7.5-11 - 40-63 7-10

5 미생물의 생육곡선 (1) 미생물의 생육곡선(대장균)

6 미생물의 생육곡선 (2) 유도기(잠복기, lag phase, induction period) 균이 환경에 적응하는 시기
세포가 성장하는 시기 대수기(증식기, logarithmic phase) 균체수가 대수적으로 증식하는 시기 세포의 생리활성이 가장 강한 시기 정지기(정상기, stationary phase) 영양물질고갈 대사 생성물의 축적 생균수는 증가하지 않음 포자를 형성하는 시기 증식속도가 서서히 늦어져서 사멸균수와 분열균수가 평형하게 되는 시기 사멸기(감수기, death phase) 생균수 감소 세포의 사멸 자가소화(autolysis)

7 미생물의 생육에 관계하는 조건(1) 물리적인 요인 온도(temperature) 분류 예 저온균(Psychrophile)
최저증식 온도(℃) 최적증식 최고증식 예 저온균(Psychrophile) -10∼5 10∼20 20∼40 수생균(Vibrio 등 ) 부패균(Pseudomonas등) 중온균 (Mesophile) 10∼5 25∼40 40∼50 사상균, 효모, 병원균(세균) 고온균(Thermophile) 40∼45 55∼75 60∼80 온천균(Sulfur bacteria 등), 유아포간균 (Bacillus, Clostridium) 물리적인 요인: 온도

8 미생물의 생육에 관계하는 조건(1) 물리적인 요인 삼투압(osmotic pressure) 종 류 최적 염농도 예
종  류 최적 염농도 예 비호염성균(nonhalophile) 미호염성균(slight halophile) (해수세균포함) 중등도호염성균(moderate halophile)  고도호염성균(extreme halophile) 2% 2-5% 5-20% 20-30% 대장균군, Spirillum Pesudomonas, Vibrio, Alteromonas, Flavobacterium Micrococcus, Vibrio, Pediococcus, Schizosaccharomyces Halobacterium sarcina 물리적인 요인: 삼투압

9 미생물의 생육에 관계하는 조건(1) 물리적인 요인 광선 가시광선 이상의 장파장에는 살균력은 없음
4000Å이하의 자외선은 미생물에 대하여 살균력을 나타냄 2650Å 부근의 파장은 가장 강하게 작용 X선, γ선(radation) 조사량에 따라서 변이주를 내게 하거나 사멸시킴 γ선의 작용은 조사에 의해서 미생물의 주변 물질의 분자가 이온화되어서 유리기를 내고 그것이 세포내의 생체고분자물질과 반응해서 미생물의 기능장해를 가져옴 물리적 요인: 광선/X선, γ선

10 그람양성균과 음성균의 비교

11 미생물의 생육에 관계하는 조건(2) 화학적 요인 수분(water) 미생물의 증식과 Aw(전반적 경향) 미생물 증식하한 Aw
세균 효모 곰팡이 0.94∼ 0.99 0.88 ∼ 0.94 0.88∼ 0.90 호염세균 내건성 곰팡이 내삼투압성효모 ≤0.75 0.65 0.60 화학적 요인: 수분

12 미생물의 생육수분활성 세 균 AW 효 모 AW 곰팡이* 불완전균 AW Pseudomonas 0.97
Achromobacter         E. coil          Bacillus subtilis        0.95 Bacillus mycoides     Cl. botulinum         Aerobacter aerogenes  0.945 Salmonella newport    Sc. faecalis             Sarcina          Mc. roseus             0.905 Staphy. aureus          호염균                  보통 식품 부패     세균의 범위 Tourulopsis utilis    Beer yeast          Schizosaccharomyces Candida utilis        0.94 Bread yeast        Mycoderma          Sacch. cerevisiae    Rhodotorula         Endomyces          0.885 Willia anomala      Sacch rouxii    (내압성 효모) 보통 효모의     범위 Mucor          Rhizopus         Penicillum        Asp. niger      Asp. flavus          0.80 Asp. candidus         0.75 Botryiis              Oospora lactis        0.895 Asp. chevalieri       0.65** Asp. repens          - Asp. ruber             - Asp. amstelodami       - Xeromyces bisporus   - 일반 곰팡이 범위  

13 pH (수소이온농도) < 미생물의 증식과 pH > 대부분의 세균 대부분의 사상균, 효모 호염기성균 호산성균 pH 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 레 몬 즙 토 마 즙 신 선 우 유 중 성 사 람 혈 액 < 미생물의 증식과 pH >

14 각종 미생물의 최저, 최적, 최고 pH 균 명 최저 pH 최적 pH 최고 pH 곰팡이 Aspergillus niger
  Coprinus sp.   Fusarium aurantiacum   Neurospora crassa   Penicillium glaucum   Phycomyces blackesleeanus 효모   Candida pseudotropicalis   Hansenula canadensis   Saccharomyces cerevisiae 방선균   Streptomyces coelicolor   S. scabies    세 균   Escherichia coli   Corynebacterium diphtheriae   Thiobacillus thiooxidans   Nitrobacter sp. 2.3 2.1 4.4 6.0 1.0 6.6 6.9 8.8 8.6 9.0 8.3 10.0

15 (Aerotolerant anaerobe) (Facultative anaerobe)
산소(oxygen) 종  류 성  질 예 편성혐기성균 (Obligate anaerobe) 산소를 이용할 수 없을 뿐만 아니라 증식에 유해 Clostridum속 Methano-bacterium속 내성혐기성균 (Aerotolerant anaerobe) 산소를 이용할 수는 없지만 증식에 유해하지는 않음 Butyribacterum속 Steptococcus속 통성혐기성균 (Facultative anaerobe) 산소가 있으면 이용하는데 산소가 없어도 증식 Escherichia coil Saccharomyces속 미호기성균 (Microaerobe) 대기보다 상당히 낮은 농도(10% 이하)가 적합하며, 높은 농도에서는 증식하지 않음 수소산화균 등 편성호기성균 (Obligate aerobe) 증식에 산소를 필요, 단 높은 농도에서 유해인 경우가 있음 곰팡이 등

16 미생물의 증식에 영향을 주는 인자 항 목 고려해야만 될 사항 배지 ① 영양원의 종류와 농도
항  목 고려해야만 될 사항 배지 ① 영양원의 종류와 농도   탄소원, 질소원, 무기염류, 필수영양소 등 ② 물리적 성상     고체, 액체, 점도 ③ pH ④ 그 외의 첨가물     전구물질, 소포제 등 ⑤ 경제성 온도 산소 ① 호기성     배양기, 진탕횟수, 통기량, 교반속도, 공기압 등 ② 혐기성 ③ 탄산가스 농도 등 접종균(전배양) 전배양의 배양조건, 배양시기(배양령), 접종량 배양시간

17 미생물의 분리 및 방법 선영_다시 그릴예정

18 대표적인 분리용 배지 목적하는 미생물 배지의 명칭 세균 Nutrient 배지, Bouillon 배지 방선균
Bennet 배지(glucose, beef extract, yeast, casitone) 효모 맥아즙배지, 국(Koyo 즙) 배지 곰팡이 감자배지, 국배지, Czapek-Dox 배지, Sabouraud 배지

19 미생물보존법 방법 적용되는 미생물 원리 ∙ 기타 계대배양 이 방법을 사용할 수 없는 미생물이 있다.
고체배지 배양하여 보존, 장기 보존에 부적당하다. 유동성 paraffine 중층법 곰팡이 ∙ 효모 · 방선균 · 호기성세균 계대배양법을 개량한 것으로 보존기간이 연장된다. 동결건조법 대부분의 세균 · 방선균 · 효모 · 곰팡이의 포자 · 바이러스 세포를 동결건조하여 정지 상태에 보존, 보존기간이 길다. 동결보존법 (-20∼-196℃) 가장 적용범위가 넓고 곰팡이 균사, 원충, 조류, 동식물 세포도 가능하다. 세포를 동결상태로 보존 건조보존법 세균 ·효모 · 곰팡이 · 바이러스 등 감압 하에서 현탁액의 수분을 증발시킨다. 담체보존법 포자를 형성하고 건조에 강한 미생물(곰팡이, 방선균, 일부의 세균) 세포를 토양 · 모래 등과 혼합한 다음 건조시킨다. 현탁액법 곰팡이 · 효모 · 방선균 · 세균 등 세포를 유기영양원을 함유하지 않은 완충액 등에 현탁

20 미생물배양법 배양방법 배양미생물 배 지 목적과 이용 배양장치 1. 고체 배양법 1) 고체사면(평판) 배양법
배  지 목적과 이용 배양장치 1. 고체 배양법 1) 고체사면(평판) 배양법 2) 고체천자 배양법 3) 거대 배양법 호기성 미생물 혐기성 미생물 고체 배지 균의 분리, 생육 상태 관찰, colony 상태, 균의 보존 생육 상태 관찰, colony 상태, 혐기성 균의 보존 colony 관찰 각종 시험관, 패트리접시, 생장관찰 시험관, Burri 시험관 패드리 접시 2. 액내(체)배양법(통기배양) 1) 진탕 배양법 2) Jar fermenter 액체 배지 생리연구, 균체생산, 대사연구 균체양산, 대사산물 양산    진탕 플라스크 Monod관(L자 시험관, T자 시험관) Jar fermenter(소형) 3. 연속 배양법 증식, 대사활성 Chemostat, turbidostat 배양

21 배양 형식 액체배양 표면배양법(surface culture) 심부배양법(submerged culture)
진탕배양법(shaking culture) 고체배양 장 점 단 점 원료 잡균오염 생산물의 회수 산소공급 원료의 유효이용 배지중의 pH, 온도, 수분 등 환경조건의 측정 및 제어 등이 어려움 미생물의 측정과 생산물과의 측정 등이 곤란함 적당한 배양법확립이 어려움

22 기질의 공급방식에 따른 배양법(1) 회분배양 (batch culture)
처음 공급한 원료기질이 모두 소비될 때까지 목적물의 발효생산을 계속시키는 방법, 대부분의 발효공업에서 행해짐 연속배양 (continuous culture) 장점 고효율 생산비가 낮음 품질관리가 용이 기초연구의 좋은 자료 단점 생산성이 낮음 오염문제 균주의 변이, 퇴화 qo 회분배양, 연속배양

23 기질의 공급방식에 따른 배양법(2) 유가식배양 (fed-batch culture)
배양액을 빼내는 일없이 배지를 연속 또는 간헐적으로 공급하는 배양법 catabolite repression에 의한 목적 생산물의 생성이 억제되는 경우 영양요구성주의 배양에서 요구물질(아미노산 등)을 첨가하는 경우 유가식배양

24 미생물반응 공정도

25 발효공정상의 조건과 장치적 특정 항 목 특 징 장치적 특징 (화학반응장치와 비교하여)
항  목 특    징 장치적 특징 (화학반응장치와 비교하여) 특별한 것 이외에는 한 계열의 장치로 원료, 운전조건, 균주를 바꿈으로써 각종(아미노산, 핵산, 항생물질 등)의 발효가 가능, 목적 범용 장치 조직적 특성 대부분은 회분조작 전형적 운전조건 화학장치에 비교하여, 온화한 조건 (1) 온도               상온, 25-35℃ (2) 압력              ㎏ / ㎠G (3) 살균조건          온도 ℃                    압력 0-3㎏ / ㎠G (4) pH                (5) 필요산소량      ㎏ ․ mol / ㎥ ․ hr      KLa            (L/ hr)      통기량           VVM      무균성의 필요 화학장치와 달리 원료, 공기 등의 살균, 제균이 필요

26 식품관련 발효미생물(1) 곰팡이(絲狀菌, fungi) ◆ Aspergillus 속
Aspergillus oryzae : 황국균, amylase와 protease 생산능력이 강하여 곡류와 콩을 이용한 양조 및 장류제조 등에 이용 Asp. niger : 흑국균,  pectin 분해력이 강, 당화액을 발효하여 수산(oxalic acid), 그루콘산(gluconic acid), 구연산(citric acid) 등의 유기산제조 이용, cellulase와 amylase 등의 강력한 내산성 당화효소 생산 Asp. awamori : 당화와 동시에 구연산을 다량으로 생산, 전분을 이용한 소주제조에 이용 Asp. sojae : 장류 제조에 많이 이용 Asp. flavus : 발암물질인 aflatoxin을 생산 Asp. graucus : 식품의 부패에 관계하는 균종

27 식품관련 발효미생물(2) ◆ 거미줄곰팡이(Rhizopus 속)
Amylase 및 protease의 활성이 강한 것이 많고 glucoamylase의 생산에 이용. lipase의 중요한 생산균주. R. javanicus :  강력한 전분 액화력과 당화력 및 알코올 발효능력을 가지고 있어 알코올 발효에 이용 R. nigricans : 빵곰팡이,  빵 ∙ 곡류 ∙ 과일 등에서 흔히 볼 수 있음 R. delemar : 전분당화력이 강하여 포도당제조시에 사용되는 당화효소(glucoamylase)제조에 이용, 알코올 발효에 사용 R. japonicus : 전분당화력이 강, amylo법에 이용되는 균

28 식품관련 발효미생물(3) ◆ 털곰팡이(Mucor 속)
M. rouxii :  전분당화력이 강하기 때문에 amylo 법에 의한 알코올 제조에 사용되었으나 현재는 이용하지 않고 있음 M. mucedo : 마분곰팡이라 불리움, 식품공업에는 이용되지 않고 있음 M. hiemalis : pectinase 분비력이 강함 M. pusillus : 치이즈 제조에 필요한 응유 효소의 생산 균주로 유망 ◆ 활털곰팡이(Absidia 속) 동물의 병원균이라고도 함, 식품에서는 부패통조림에서 분리 대표적인 균종에는 A. lichtheimi이 있음

29 식품관련 발효미생물(4) ◆ 푸른곰팡이(Penicillium 속)
Pen. chrysogenum : penicillin 생산에 이용되는 유익한 균 Pen. notatum : Flemming이 최초로 발견한 penicillin 생산균 Pen. camemberti : 프랑스의 Camebert cheese의 숙성에 관여하는 균 Pen. roqueforti : 프랑스의 유명한 Roquefort cheese의 숙성과 향미에 관여하는 균 Pen. citrinum : 황변미의 원인 균, 신장장애를 일으키는 황색의 유독색소 citrinin을 생성

30 식품관련 발효미생물(5) ◆ 홍국곰팡이(Monascus 속)
M. purpureus : 홍주(紅酒)를 제조에 사용,  방부력을 갖는 적황색의 색소를 생산, 알코올 발효 능과 amylase, protease, lipase, pectinase와 같은 가수분해 효소들을 생산 cholesterol 합성 저해능을 갖는 monacolin K를 생성 혈압강하작용의 유효성분인 Υ-aminobutyric acid를 생산 M. anka : 홍국 홍유부(紅乳腐)의 제조에 이 과즙의 청징제 제조에 이용 ◆ 붉은 빵곰팡이(Neurospora 속) 비타민 A에 대한 연구 등을 위해서 Neu. crassa나 Neu. sitophila가 이용되고 있음

31 식품관련 발효미생물(6) 효모 ◆ Saccharomyces 속
Sacch. cerevisiae : 전형적인 맥주의 상면발효 효모 Sacch. carlsbergensis : 맥주의 하면발효 효모 Sacch. ellipsodeus : 포도주 발효 효모, Sacch. cerevisiae  보다 약 2배 크고 세포는 타원형 Sacch. fragilis와 Sacch. lactis :  케퍼(Kefir)를 제조하는데 이용 Sacch. rouxii : 내삼투압성 효모이며, 간장 숙성과정에서 지방질을 분해하여 특유의 향미를 주는 유익한 효모 Sacch. mellis : 내삼투압성 효모이며 고농도 당을 함유하는 벌꿀, 잼 등에서 생육하여 품질을 저하시킴

32 식품관련 발효미생물(7) ◆ Schizosaccharomyces 속
pombe가 대표적인 효모,생육적온이 37℃, 알코올 발효능이 강함 ◆ Pichia 속 산막(酸膜) 효모로서 당의 발효 능은 전혀 없던가 미약하고 산화적 당대사를 행함 알코올과 유기산으로부터 에스터를 생성하여 포도주에 특유의 향기를 주는 균주도 있음 P. alcoholophila : 맥주나 포도주의 유해균 P. membranaefaciens : 10% 전후의 알코올 함유액에서 잘 생육하면서 알코올 및 ester를 분해 소실시킴

33 식품관련 발효미생물(8) ◆ Candida 속 C. mycoderma : 양조식품의 변패효모
C. utilis : glucose와 sucrose는 발효하나 maltose와 lactose는 발효하지 못함 C. tropicalis : 단세포단백질(single cell protein)제조에 이용 ◆ Rhodotorula 속 세포는 구형으로 알코올 발효력은 없으나 적색 또는 황색의 carotenoid계 색소를 생성하는 것이 특징, R. glutinis는 지방 집적력이 강하여 유지 효모로 알려져 있음

34 식품관련 발효미생물(9) ◆ Lactobacillus 속 세균(細菌, bacteria)
L. bulgaricus : 발효적온은 40∼45℃, 유당으로부터 다량의 젖산을 생성하므로 요구르트 제조에 널리 이용 L. acidophilus : 내산성이 강하여 장내에서 생육하고 정장작용이 강하여 젖산균제제나 발효유의 일종인 acidophilus milk 제조에 이용 L. plantarum : 치즈, 김치류, silage 등의 발효에 주로 관여 L. sake : 청주의 양조에 관여

35 식품관련 발효미생물(10) ◆ Bifidobacterium 속
그람 양성, 편성혐기성균, 당을 발효하여 젖산을 만드는 작용을 함, 초산도 생성,  병원균의 감염으로부터 우리 몸을 보호. 장내의 부패를 억제. 비타민을 만들어냄. 장운동을 촉진하여 변비를 예방. 설사의 예방과 치료에 효과. 몸의 면역력을 강화, 발암물질을 파괴하여 암을 예방. Bifidobacterium longum Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium lactis Bifidobacterium thermophilum

36 식품관련 발효미생물(11) Leuconostoc mesentroides : 김치 발효균, 정장작용
◆ Pediococcus 속 Ped. cerevisiae : 김치, 피클 등의 발효균 Pediococcus acidilactici : 내염성, 내열성, 쓰레기 발효제 ◆ Leuconostoc 속 Leuconostoc mesentroides : 김치 발효균, 정장작용 Leuconostoc citreum : 동치미로 분터 분리, 정장작용

37 식품관련 발효미생물(12) ◆ Bacillus 속 내열성포자를 형성, 적당한 조건이 주어지면 출아하여 영양세포로 됨
B. subtilis : 고초균, 강력한 protease와 amylase를 생산하기 때문에 효소제 생산균 또는 콩을 원료로 하는 장류나 청국장의 제조에 이용 B. natto : 납두균이라고 하며, 청국장 제조에 관여하는 끈기 있는 균으로 마른 풀 등에 존재, 강력한 protease와 amylase를 생산

38 식품관련 발효미생물(13) ◆ Clostridium 속 포자를 형성하는 그람 양성간균 중 편성혐기성 세균, 통조림 부패세균
Cl. botulinum : 식중독 균 Cl. perfringens : 식중독 균 Cl. acetobutylicum : acetone-butanol 발효에 관계 ◆ Acetobacter 속 무포자, 그람 음성의 호기성 간균, 에탄올을 호기적으로 산화하여 초산을 만드는 세균이므로 초산균으로 불림 A. aceti : 식초 양조에 사용 A. rancens : 포도주초 양조에 이용

39 식품관련 발효미생물(14) ◆ Corynebacterium 속 그람 양성이고 운동성이 없는 간균으로 biotin을 생육에
필요로 하는 균 Corynebact. glutamicum : 당질에서 글루탐산을 공업적으로 생산하는데 이용 각종 필수아미노산들을 공업적으로 생산하는 균주로서 이용 ◆ Escherichia 속 그람 음성으로 사람이나 동물의 대표적인 장내세균