크로마토그래피 고정상과 이동상으로 구성된 분리시스템으로 혼합물의 성분을 이동상의 흐름에 따라 고정상을 통해 운반되고

Presentation on theme: "크로마토그래피 고정상과 이동상으로 구성된 분리시스템으로 혼합물의 성분을 이동상의 흐름에 따라 고정상을 통해 운반되고"— Presentation transcript:

1 크로마토그래피 고정상과 이동상으로 구성된 분리시스템으로 혼합물의 성분을 이동상의 흐름에 따라 고정상을 통해 운반되고 시료성분들의 이동속도의 차이에 따라 분리하는 방법 필터(filtration)의 이론 분리단수의 무한대 확장 개념…..

2 최근에는 HPLC, GC, GPC, SCFLC, 전기 크로…등 다양한 기술 발전
크로마토그래피 이동상 고정상 기체-액체 기체 액체 기체-고체 기체 고체 분배 액체 액체 흡착 액체 고체 종이 액체 액체 TLC 액체 액체, 고체 겔 액체 고체 이온교환 액체 고체 고정상 고정 – 이동상 이동 ( 용리) 용리 : elution – 새로운 용매를 관을 통해 가하여 용질을 씻어내리는 과정 최근에는 HPLC, GC, GPC, SCFLC, 전기 크로…등 다양한 기술 발전

3

4 실제 크로…에서는 peak이 이론적으로 나타나진 않는다. -왜 ??? 1) Eddy diffusion (소용돌이 확산)
물질 확산의 방향성 문제  관이 가늘수록 극복 2) longitudinal diffusion (종축확산) 물질이동의 선택방향 문제  관이 짧을수록 극복 3) non-Equilibrium transfer (비평형 질량이동) 물질평형을 위한 시간적 손실  유속감소로 극복 실제적 고려: 관을 가늘게도, 짧게도, 유속을 천천히도 못함. 1x15 (직경 x 높이)이상으로 유지 (유속은 경험적) Dead volume을 최소화 하는것이 좋다.

5 물질분리의 영향인자 고정상의 종류 Column 길이비 용질 이동속도 용매 종류 및 이동속도 크로마토그래피의 정성 및 정량분석 정성분석 : Rf, Rg.등 retention time (RT) 정량분석 : 봉우리 높이 봉우리 면적 표준물에 의한 검정 (내부표준법, 외부표준법) 동일물질 : 다른 고정상-이동상에서 동일한 RT를 유지하여야….

6 액체크로마토그래피 - 충진물의 종류, 크기에 영향 받으며, 고정상 충진물의 크기가 10um 이하일 경우 분리능이 향상 - 그러나 이 경우 용매 이동 (용리)을 위해서는 고압이 필요  HPLC HPLC의 구성 1.용매저장장치, 기체제거장치 - 용존산소 (용존질소) bubble, - 분리능 감소 - 기계 파손 (특히 컬럼 및 펌프) 2. 펌프 - 일정한 유속 유지, 고압 발생 (1000 psi) lbs/in2 3. 시료주입장치 4. 예비관, 컬럼 5. 온도조절기 6. 검출기

7 HPLC

8 역상 (reverse-phase)

9

10

11

12

13

14

15 제 5장 Gel permeation chromatography
다양한 (고)분자들의 분리방법의 기본 방법 : charge + molecular size 장점 Mild condition (부서지기 쉬운 물질의 분리에 사용가능) 부서지기 --- 생물학적 활성 (구조와 기능…) 2. 뛰어난 회수력 (~100% recovery) 3. 높은 재현성 4. 확장 (상업용 scale) 용이성 5. 경제성 있는 시설, 높은 생산성 (짧은 분리시간)

16 Media elution Total column volume (Vt) Gel volume (Vx) Void volume (Vo) Elution volume (Ve) REV (relative elution volume) = Ve / Vo R (inverse of REV) = retension constant = Vo / Ve Distribution coefficient (Kd) = (Ve-Vo) / Vx See Fig. 5.3 (p171)

17 Gel filtration media 1. Chemical inertness
2. Low content of ionic group 3. Uniform pore and particle size 4. Wide choice of gel particle and pore size 5. High mechanical rigidity Sephadex (polydextran) (produced by L.mesenteroides) PA gel Agarose gel Agarose –PA gel Starch gel

18 Preparation of the column
A small dead space Facilities (column vs effluent tubing) A gel bead (anti-clogging : nylon screening) Some means of protecting the bed surface * Glass wool : manipulation in Hood Packaging (even, and slow packing, height x diameter, hydrostatic pressure) Maintenance - a safety loop Determination of the void volume. - Blue dextran 2000 (MW 2x106)

19 Sample application and chromatography
주의사항 Sample Size (loading volume) Viscosity Ionic strength : should be greater than 0.08 P187 ~ p 189

20 기타의 크로마토그래피….. 흡착크로마토그래피 - 용질이 고체표면의 자리를 차지하기 위해 용리 용매와 경쟁
(즉 흡착력의 결과로 머무름 현상이 나타남) 고정상 – 실리카겔, 알루미나 이동상 – 실험목적에 맞는 용매 (용매선택이 중요) 경험적, 시행착오법으로 용매 결정 2. 분배크로마토그래피 -