DNA 전기영동.

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1 DNA 전기영동

2 전기영동 (Electrophoresis)
전기장 안에서 하전된 입자(물질)가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상 이동하는 속도에 미치는 영향 - 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액(Buffer)에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 - 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결 정됨 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 등과 같은 하전된 물질들을 분리, 분석시 매우 효과적인 수단으로 이용 전기영동은 주로 하전된 분자(이온)에 한정 유동성 매체로 액체 또는 기체가 사용 - 생물학적 시스템에 있어서는 액체를 주로 이용

3 DNA 전기영동의 원리 DNA 전기영동이란 Agarose을 이용하여 전기적인 힘을 이용하여 DNA를 분리할 때 사용
DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 음(-)전하를 띔 - 두 전극 사이에 위치했을 때 양(+)극 쪽으로 움직임 DNA분자가 gel matrix 사이를 통과하는 속도 - 분자량이 커질수록, gel matrix가 치밀할수록 늦어짐 - DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라 달라짐

4 DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) 구조
Phosphate Sugar Base Phospho diester bond (DNA가 음전하를 띄는 이유) Hydro bond

5 DNA 전기영동의 원리

6 DNA 전기영동시 DNA이동에 영향을 주는 요인들
- Agarose 격자구조 때문 2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동 - 분리에 적합한 염기크기에 따라 agarose gel의 농도 설정 Agarose gel 농도 분리에 적합한 염기 크기 0.3 % 60~5 kbp 0.6 % 20~1 kbp 0.7 % 10~0.8 kbp 0.9 % 7~0.5 kbp 1.2 % 6~0.4 kbp

7 DNA 전기영동시 DNA이동에 영향을 주는 요인들
- 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그 다음 linear DNA, open circular 순으로 빠르게 이동한다 형태 그림 이동 빠르기 Covalently closed circular 1 Circular 2 Open circular 4 Linear 3

8 DNA 전기영동시 DNA이동에 영향을 주는 요인들
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠름 5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미침 - DNA가 (-)전하를 띄기 때문에 (-)  (+)방향으로 전기영동을 실시 6) EtBr은 DNA 이동속도를 감소시킴 - DNA 수소결합 사이에 EtBr이 끼어들기 때문에 상대적인 DNA 무게 증가

9 전기영동 시 Gel의 선택 1) Gel의 종류에 따라 달라진다.
- Agarose gel : 분자량이 100bp~20kbp, 해상력이 낮음 - Polyacrylamide gel(PAGE) : 분자량이 작을때(10bp~1000bp) 해상력이 높음 2) 핵산의 denaturation에 따라서 선택 - DNA : non-denaturating gel, 염기서열 분석시 denaturing gel 사용하기도 함 - RNA : Denautring gel (Alkaline, formaldehyde, Urea등 첨가) 3) 분리하고자 하는 물질에 따라 - DNA : Agarose gel, PAGE - RNA : Formaldehyde agarose gel - Protein : SDS-PAGE

10 전기영동 시약 ① TAE buffer ② Agar ③ ladder
④ loading dye - ⅰ) 높은 밀도 -> DNA를 well내에 안착하게 함 ⅱ) 염색성분을 가지므로 loading정도를 눈으로 확인가능 ⑤ EtBr (ethidium bromide) - 대표적인 DNA염색물질로, 전기영동을 통한 DNA의 확인에 사용된다. <발암물질이므로 주의>

11 Material 전기영동장치 1 x TAE buffer 팁(tip) 마이크로피펫(micropipette)
Ethidium bromide(EtBr) UV Transilluminator 0.8% agarose gel Loading buffer 증류수

12 + - - + Method H  O2  Power Polymerized agarose is
porous, allowing for the movement of DNA Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)

13 Method DNA + - Power small large

14 Agarose Gel Buffer Flask for boiling Agarose

15 Electrophoresis Equipment
Power supply Buffer Cover Gel tank Electrical leads  Casting tray Gel combs Agarose

16 Agarose Gel Buffer Agarose Buffer Solution Agarose

17 Agarose Gel Pouring the gel Buffer Agarose

18 Agarose Gel Pouring the gel Buffer Agarose

19 Pouring the gel Agarose Gel Buffer DNA buffer   wells    Anode
(positive) Cathode (negative) Agarose

20 Agarose Gel Pouring the gel Buffer Agarose

21 Agarose Gel Pouring the gel Buffer Agarose

22 Pouring the gel Agarose Gel Cathode (-) Buffer  wells
DNA (-)   Bromophenol Blue Gel Anode (+) Agarose

23 DNA Ladder Standard - + DNA migration  12,000 bp  5,000  2,000
 100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400  12,000 bp  5,000  2,000 DNA migration Note: bromophenol blue migrates at approximately the same rate as a 300 bp DNA molecule bromophenol blue +

24 DNA 전기영동

25 실험시 주의사항 (1) EtBr은 발암물질이므로 신체에 닿지 않도록 각별히 주의를 기울이고, 관련 기기와 소모품들은 특별관리 및 처분한다. (2) UV광학기의 자외선을 눈으로 직접 쐬지 않도록 주의한다. (3) 만들어진 Agarose gel에 시료를 주입할 때, 피펫의 끝이 다른 곳을 찌르지 않도록 주의하고, 90도 직각아래로 너무 깊숙이 찌르지 않도록 하며, 천천히 주입한다. (4) 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. (5) agarose 용액을 주형에 부을 때, 기포가 생기지 않도록 주의한다.

26 Green Fluorescent Protein (GFP)
The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 amino acid residues (26.9 kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. Although many other marine organisms have similar green fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jellyfish Aequorea victoria. In cell and molecular biology, the GFP gene is frequently used as a reporter of expression. In modified forms it has been used to make biosensors, and many animals have been created that express GFP as a proof-of-concept that a gene can be expressed throughout a given organism. To date, the GFP gene has been introduced and expressed in many Bacteria, Yeast and other Fungi, fish (such as zebrafish), plant, fly, and mammalian cells, including human. 

27 Subcloning EcoRI GFP KpnI pLitmus28-GFP

28 Method pLT28-GFP 3ul EcoRI / KpnI 0.5ul / 0.5ul 10X Reaction Buffer
1. subcloning할 plasmid DNA를 준비한다 2. plasmid DNA에 Enzyme을 처리한다 3. 37℃ 에서 10 ~ 20분 배양한다. 4. 1% Agarose gel에 6x DNA Loading Dye를 섞어 전기영동을 한다. ( Size 확인을 위해서 DNA Ladder를 같이 Loading 한다 ) 5. EtBr Staining 5 ~ 10분 6. 원하는 Size를 관찰한다. (UV lamp) 7. Gel 을 잘라서 -20℃에 보관한다. pLT28-GFP 3ul EcoRI / KpnI 0.5ul / 0.5ul 10X Reaction Buffer 2ul TDW (up to 20ul) 14ul Reaction Sample(2번) 20ul 6X Loading Dye 4ul