Section 1-9 탈회 (Decalcification).

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1 Section 1-9 탈회 (Decalcification)

2 Decalcification (탈회) 탈회의 원리
조직 내에 부분적으로 석회화 (골조직이 포함된 기형종, 결핵병소, 주사 후에 발생한 농양부위, 석회화된 병소)가 발생된 조직은 주성분이 무기질인 칼슘염(calcium salt)이 존재하여 paraffin 침투과정을 거쳐 박절하게 되면 절편이 찢어지고 표본의 제작이 불가능하며 칼날을 손상시킨다. 석회화된 조직들은 고정을 완료한 후 조직 과정단계를 거치기 전에 석회화된 부위에 침착되어 있는 칼슘염이나 인산염을 제거하여 조직을 연화해야 하는데, 이 과정을 탈회(decalcification) Decalcification (탈회)

3 Decalcification (탈회) 탈회의 원리
작은 뼈조직이나 골수 천자 생검같이 부피가 작은 조직은 고정 후 그냥 탈회해도 되지만 절단 검체(amputation)나 femur head 같은 뼈조직은 뼈 절단용 전기톱(bone cutter), 저고속 톱(low speed saw)을 이용해 두께 3~5 mm 정도로 자른 후, 고정 및 탈회 과정을 거친다. Decalcification (탈회)

4 Decalcification (탈회) 탈회 처리과정 조직의 선정 ⇒ 고정 ⇒ 탈회 ⇒ 중화 ⇒ 수세
탈회에는 흔히 산(acid)을 사용 산은 칼슘염을 용해하는 작용이 있으나 골이나 다른 조직을 구성하는 유기질에 손상을 입히므로 이를 방지하기 위해서는 탈회에 앞서 적당한 고정이 필요 골수조직은 Bouin 고정용액이 추천 Decalcification (탈회)

5 Decalcification (탈회) 탈회 방법 산(acid) 용액에 의한 탈회법
뼈조직에서 칼슘이 금속염(calcium carbonate, calcium phosphate)으로 존재하는데 산 (negative ion)은 뼈조직 내의 calcium 결합 (positive ion)을 용해하여 용해성 칼슘(soluble calcium)으로 만드는 이온 교환의 작용 산 용액은 과도하게 사용할 경우 조직 성분의 수축, 용해, 섬유질의 팽화를 유발하고 핵의 염색성 저하 등의 장애를 주어 methyl green-pyronin 염색과 같은 핵산염색에 사용할 수 없다. Decalcification (탈회)

6 Decalcification (탈회) 탈회 방법 산(acid) 용액에 의한 탈회법 탈회액의 양 뼈조직에 지방질이 많을 경우
조직의 20~40배 이상으로 하고 용출된 칼슘 성분은 탈회과정을 방해하므로 자주 새 용액으로 교환 뼈조직에 지방질이 많을 경우 지방성분은 탈회 수용액의 접촉을 방해하여 탈회가 지연될 수 있기 때문에 alcohol을 첨가 뼈가 탈회될 때 뼈의 표면에 작은 기포가 생기는데 이는 이산화탄소(CO2)로 가끔 용액을 흔들어 주어 제거해야 뼈의 표면과 탈회용액이 접촉되어 탈회가 진행 Decalcification (탈회)

7 Decalcification (탈회) 탈회 방법 산(acid) 용액에 의한 탈회법의 종류
5% 질산 수용액(Nitric acid) 가장 많이 이용되는 방법으로 강산 탈회제 5% nitric acid - alcohol 용액 지방을 많이 함유하고 있는 뼈조직의 탈회에 적당 Formalin - Nitric acid 용액 Hydrochloric acid 용액 강산 탈회제로 탈회력이 약하므로 많이 쓰이지는 않는다. Decalcification (탈회)

8 Decalcification (탈회) 탈회 방법 산(acid) 용액에 의한 탈회법의 종류 5% Formic acid 용액
약산 탈회제로 탈회력이 강하지 않아 치밀골에는 사용치 않는 것이 좋다. Acetic acid, Picric acid 약산 탈회제로 Carnoy 용액과 Bouin 용액에 각각 포함되어 있으므로 고정과 동시에 탈회를 하여야 하는 급한 경우에 사용 Trichloroacetic acid 약산 탈회제로 치아의 탈회에 우수 Decalcification (탈회)

9 Decalcification (탈회) 탈회 방법 조직 화학적 탈회방법
뼈조직을 효소나 기타 화학성분을 증명하고자 할 때 탈회를 위해 강산을 사용하면 조직 내 효소의 활성이 파괴되고 핵산이나 다당류의 검사도 일반 탈회액으로는 불가능 citrate buffer나 EDTA와 같이 금속과 착염 (킬레이트, chelate)를 형성하는 유기화합물을 사용 Decalcification (탈회)

10 Decalcification (탈회) 탈회 방법 조직 화학적 탈회방법 완충액(Citrate buffer)을 이용한 탈회
Citric acid-citrate buffer(pH4.5) 용액 매일 용액을 신선하게 교환해 가면서 탈회 진행 정도를 화학적 검사인 calcium oxide 검사로 점검 착염(chelate)를 이용한 탈회 Chelate 화합물인 EDTA는 칼슘이온과 잘 결합하여 탈회과정 중 뼈조직에는 손상이 없으며, artefact가 적고 염색결과가 좋아 연구용 뼈 검체에 사용 검체의 두께는 5mm 이내라야 하며 용액은 4~5일 마다 새 것으로 교환 종료시점은 X-ray 촬영이나 oxalate를 사용하는 화학적 방법을 이용 용액의 양은 검체 크기의 50배 Decalcification (탈회)

11 Decalcification (탈회) 탈회 방법 이온 교환 수지(ion exchange resin) 탈회법
탈회용액에 이온교환수지를 사용하는 것은 탈회용액으로 부터 칼슘이온을 제거하기 위한 것 골조직을 고정한 후 탈회액인 formic acid 용액에 의해 유리된 calcium은 바닥으로 가라앉는다. 유리된 칼슘은 탈회를 방해하므로 탈회용기 저면에 calcium ion을 흡착할 수 있는 이온교환수지(resin)을 깔면 용출된 칼슘이 바닥에 있는 resin으로 이동되어 흡착되므로 탈회액이 항상 청정한 상태에서 탈회가 진행되며 탈회속도가 빨라진다 Decalcification (탈회)

12 Decalcification (탈회) 탈회 방법 이온 교환 수지(ion exchange resin) 탈회법
장점은 단순 산 탈회법에 비해 세포의 미세구조가 잘 보존되며, 탈회가 신속하고, 매일 용액을 교환하지 않아도 된다. Decalcification (탈회)

13 Decalcification (탈회) 탈회 방법 전기분해(electrophoretic decalcification) 방법
원리는 양극(anode)에 뼈조직을 부착하고 전해질 용액에 전기를 통전하여 칼슘이온이 음극(cathod)으로 이동시키는 힘을 이용한 방법 8% 염산과 10% 포름산 동량 혼합액 산성액 탈회법보다 신속한 탈회 Decalcification (탈회)

14 Decalcification (탈회) 탈회 방법
자기장을 이용한 방법(Magnetic decalcification method) 자기장 탈회장치를 사용하여 조직 손상을 최소화하고 빠르고 완전한 탈회를 시행하여 박절 시 발생하는 어려움을 최소화한 방법 거대 표본 제작 시 신속하고 손상을 최소화 하는데 적절한 방법 탈회방법은 5% nitric acid를 사용하여 기계를 작동시키면 작은 표본은 하루(overnight) 정도 소요되고 큰 표본인 경우 이틀 정도면 충분히 탈회가 되는데 이때 가라 앉았던 골 조직표본이 떠오른다. Decalcification (탈회)

15 Decalcification (탈회) 탈회 방법 표면 탈회법
Paraffin block 상태로 조직이 노출된 표면을 직접 탈회액에 담가 칼슘을 제거하는 방법 충분한 탈회가 아니기 때문에 용액에서 꺼내어 탈회된 조직표면으로부터 몇 장의 절편만을 박절해 낼 수 있다. Decalcification (탈회)

16 Decalcification (탈회) 탈회에 영향을 미치는 요소 탈회시약의 농도
농도를 증가시키면 decalcify는 더 빨라질 수 있으나, 조직에 더 손상을 미친다. 교반 (agitation) 탈회의 촉진효과는 거의 없다. 온도 (Temperature) 가열을 하면 탈회율은 촉진되나 반면에 조직의 손상이 증가하고 염색성에 큰 영향을 미친다. 현수 (suspension) Decalcifying fluid는 tissue의 모든 surface에 적용을 받기 때문 Decalcification (탈회)

17 Decalcification (탈회) 탈회의 완료 시점
탈회의 완료점을 놓치게 되면 뼈조직은 과탈회되어 조직의 염색성이 저하됨은 물론 조직 성분도 파괴되므로 칼슘이 제거된 상태를 알아보는 방법이 필요 물리적 방법 핀(needle or probing)으로 찌르거나, 예리한 칼로 끝을 잘라 보아 무리 없이 잘라질 때 잘된 탈회 뼈의 굴곡도(flexiblity) , 촉감에 의한 방법 물리적 방법은 조직의 손상이 심하기 때문에 추천할 수 없다. Decalcification (탈회)

18 Decalcification (탈회) 탈회의 완료 시점 화학적 방법
탈회액내의 유리칼슘을 불용성의 calcium oxalate로 침전시켜 보는 방법 골조직에 쓰인 탈회액에 강 암모니아수를 가한 후 용액이 혼탁해지면 아직도 많은 양의 칼슘이 골조직내에 침착되어 있음을 시사한 것으로 계속하여 탈회를 하여야 한다. 정확성이 높다. Decalcification (탈회)

19 Decalcification (탈회) 탈회 방법 방사선 촬영 검사
현미방사선 연구 (microradiography)에 사용하는 연성 X-선 발생장치를 이용한 탈회정도를 판정 탈회 종료 검사 중 가장 확실한 검사법 탈회가 안된 부분은 비투과성이며, 탈회된 부분은 반투과성 Decalcification (탈회)

20 뼈를 탈회하고 있는 장면이다. 산탈회 촉진 방법으로 사용되는 것은?
가. 이온교환수지법 나. 전기분해법 다. 초음파탈회법 라 . EDTA법 1. 가, 나, 다 가, 다 3. 나, 라 가, 나, 다, 라

21 뼈를 방사선 촬영한 것이다. 다음 중 뼈 내에서 alkaline phosphatase를 검출하기 위해 사용할 수 있는 탈회제는?
가. formic acid 나. EDTA 다. nitric acid 라 . citarte buffer 1. 가, 나, 다 가, 다 3. 나, 라 가, 나, 다, 라

22 산탈회 후 calcium oxalate test로 탈회가 종료되었는지 검사하고 있다. 왼쪽 병은 탈회가 진행되고 있는 상태이다
1. ammonia water ammonium oxalate 3. calcium carbonate calcium hydroxide