Download presentation
Presentation is loading. Please wait.
1
Chapter 6 재조합 DNA 제작과 세포로의 도입 및 확인 ① 재조합 DNA ② 유전자의 대장균내 도입 방법
③ 형질 전환된 세포의 선발 ④ 재조합 DNA 기술의 전 과정
2
① 재조합 DNA 유전자 재조합(DNA 재조합기술)??? 클로닝 ??? 형질 전환???
: 특정 유전자를 분리하여, 백터와 같은 다른 유전자와의 재조합으로 키메라 유전자를 만든 다음, 다시 다양한 종류의 숙주세포로 도입하여 특정 유전자를 다량 획득하거나 또는 이 유전자를 발현시키는 기술. 형질 전환??? : 재조합 DNA를 다른 세포에 도입, 발현시키는 과정. 클로닝 ??? : DNA를 재조합하고 이를 다시 숙주세포로 도입하여 특정 유전자를 다량 획득하는 과정.
3
재조합 DNA 분자의 제작 제한 효소에 의한 재조합 DNA 분자의 제작 PCR 산물을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작
♥ 고려해야 할 사항: 사용하고자 하는 제한효소의 종류.
4
Plasmid vector를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작
벡터DNA와 삽입시킬 DNA를 특정 제한효소로 절단. (가능한 동일한 제한효소에 의해 생성된 동일한 점착성 말단을 두 DNA 분자가 보유할 수 있게 한다) Why??? b. 절단된 벡터와 삽입 DNA를 ligase로 연결. c. 숙주세포(E. Coli)로 형질전환을 통해 세포내로 도입. d. 재조합 DNA를 함유하고 있는 숙주세포를 선발한 후(How???) 증식하여 필요한 DNA를 다량 획득.
5
Q1) 벡터끼리의 자가연결을 방지하기 위한 방법 ???
송아지 장 염기성 탈인산화효소(Calf intestine phosphatase, CIP)와 같은 효소 이용. 원 리 DNA 연결효소는 한 DNA의 3’-OH와 다른 DNA의 5’-인산기 사이에 Phosphodiester 결합을 형성하는데, 만약 DNA 한 말단으로부터 인산기를 제거하면 Phosphodiester 결합을 형성할 수 없게 되므로 자가연결을 방지 . Q2) If 벡터의 삽입부위를 두 가지 종류의 제한효소로 절단이 가능하고 또한 삽입하고자 하는 외부 DNA도 이와 동일한 두 종류의 제한효소로 절단이 가능하다면 ??? 자가연결과 DNA 삽입 방향성을 걱정할 필요 없이 외부 DNA를 원하는 방향으로 벡터에 삽입 가능.
6
교재 참조 !!! Phage vector를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작
: plasmid를 사용하는 경우와는 다른 전략 사용 필요. 교재 참조 !!!
7
PCR 산물을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작
PCR(Polymerase Chain Reaction) Q) What is PCR ??? PCR 산물의 클로닝(TA cloning) Q) What is TA cloning ??? 교재 참조 !!!
8
상동 재조합 시스템을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작
Primer에 제한효소자리를 이용하는 클로닝 교재 참조 !!! 상동 재조합 시스템을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작 원 리
9
클로닝 과정 및 특징
10
② 유전자의 대장균내 도입 방법 형질 전환 반응능 세포와 형질 전환 과정 교재 참조 !!! 교재 참조 !!!
형질전환의 이용 교재 참조 !!! 반응능 세포와 형질 전환 과정 대장균 균주(E. Coli) : DH5α, XL1-Blue, BL21, JM109 etc. 반응능 세포(Competent cell) 교재 참조 !!!
11
반응능 박테리아 세포의 제작과 DNA 도입 Heat Shock
12
Electrophoration
13
Electrophoration
14
② Bacteriophage의 세포내 도입
형질감염(transfection)
15
생체외 조립에 의한 박테리아 감염
16
③ 형질 전환된 세포의 선발 Plasmid vector Phage vector How ??? ① 항생제에 의한 선발
② 삽입 비활성화에 의한 선발 ③ PCR에 의한 선발 Phage vector ① λ 유전체 크기에 의한 선발 ② phage vector가 지니는 lacZ유전자 삽입 비활성화에 의한 선발 ③ λcI 유전자 삽입 비활성화에 의한 선발 ④ spi표현형에 의한 선발 ⑤ DNA 혼성화에 의한 선발
17
재조합 plasmid vector의 확인
항생제에 의한 선발 항생제 Q) 항생제란 무엇인가 ??? : 박테리아나 곰팡이 같은 미생물 중 특정한 종은 다른 미생물들에게 치명적인 물질을 생산, 분비 . 항생제 : 자신의 주위에 다른 종류의 미생물들이 살아가지 못하도록 하기 위한 것. : 제한된 영양환경을 독점. 생존환경에서 이기고자 하는 방법의 하나. : 생명 현상에 필수적인 단백질 합성이나 DNA 복제, 전사과정에 필요한 효소작용 방해. 죽도록 만듦
18
주요 항생제의 종류와 작용
19
항생제 선발 표지자 ex. 1 : Ampicillin에 저항성을 부여하는 β–lactamase 유전자. : Ampicillin과 결합하여 ampicillin을 분해하므로 이 유전자를 포함하고 있는 vector를 함유한 세포가 Ampicillin에 저항성 .
20
항생제 선발 표지자 ex. 2 : Kanamycin에 저항성을 제공하는 NPT II(neomycine phosphotransferase type II) 유전자. : NPT ii 유전자 산물인 네오마이신 인산기 전달효소는 kanamycin을 인산화시켜 불활성화. 이 유전자를 포함하고 있는 vector를 함유한 대장균 세포가 kanamycin에 저항성
22
β lacZ( - galactosidase)의 삽입 비활성화에 의한 선발
lacZ 유전자 산물에 의한 발색의 원리: plasmid의 lacZ 유전자의 산물(α-절편)은 박테리아 염색체의 LacZ유전자의 산물과 합쳐져서 완전한 효소( - galactosidase)를 이루고 X-gal을 분해시켜 청색을 띠게 한다. β
23
삽입 비활성화에 의한 형질전환체 선발과정(A)과 실제로 발색된 colony 사진(B) :
Plasmid의 lacZ 유전자 산물( 은 대장균의 염색체 내에 존재하는 lacZ 유전자 산물( 과 함께 합쳐져서 완전한 효소 를 이루고 X-gal을 분해하여 청색을 띠게 한다. 하지만, plasmid의 LacZ 유전자 내부에 외부 유전자가 삽입되면 LacZ 유전자 산물이 만들어지지 않으므로 효소가 형성되지 못하여 X-gal을 분해하지 못하므로 대장균 colony는 흰색을 띠게 된다. Β – 절편) ω – 절편) ( - galactosidase) β
24
PCR에 의한 선발 : 삽입 유전자 확인
25
재조합 phage vector의 확인 λ Phage 유전체 크기에 의한 선발
: 37 ~52kb 사이의 DNA 크기 확인. lacZ 유전자의 삽입 비활성화에 의한 선발 : plasmid와 동일한 방법. λ cI 유전자의 삽입 비활성화에 의한 선발 Spi 표현형에 의한 선발
26
Q) spi(sensitive to P2 inhibition) 선발이란 무엇인가 ???
: 활성을 가지는 red와 gam유전자를 가지는 비재조합 phage는 XL-1 Blue MRA(P2)와 같이 P2 프로파지를 가지고 있는 bacteria숙주세포에서는 증식할 수 없는 원리를 이용한 선발 방법. λ FIX phage vector는 stuffer region에 red와 gam 유전자를 가지고 있으므로 P2 프로파지를 가지고 있는 박테리아 숙주세포에서는 증식할 수 없게 된다. 그러나, Red와 gam유전자를 포함하는 비필수부위가 삽입체에 의해 대체되면 이 재조합파지는 red-gam-가 되기 때문에 P2프로파지를 가지고 있는 박테리아 숙주세포에서 증식 가능. 오직 재조합 phage vector를 포함하는 bacteria만 증식, 선발 가능.
27
④ 재조합 DNA 기술의 전 과정 재조합 DNA 분자 제작 숙주 세포로 운반
Colon을 형성하는 다수의 세포 획득 유용 유전자의 colon 획득 or 유용 유전자의 산물이나 기능성 생명체 획득
Similar presentations
