6장. 정제된 DNA 의 조작 유전공학.

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1 6장. 정제된 DNA 의 조작 유전공학

2 DNA 조작에 필요한 기술 및 효소 1. DNA isolation.
1) Vector DNA(plasmid or Viral DNA). 2) Object DNA(Foreign DNA). 2. DNA purification. 1) RNA 제거(RNase). 2) Protein 제거(Proteinase).

3 DNA 조작에 필요한 기술 및 효소 3. Recombinant DNA 제조.
1) Restriction Endonuclease. 2) Ligase. 3) Nuclease(Exo- , Endo).

4 재조합 DNA 제조

5 DNA 조작에 필요한 효소. 1. Nuclease(핵산 가수분해 효소). Exonuclease(외부 가수분해 효소).
Endonuclease(내부 가수분해 효소). 2. Ligase(연결효소). 3. Polymerase(중합효소). DNA polymerase. Klenow fragment. Reverse transcriptase. 4. DNA modifying enzyme(DNA 수식효소). 5. Topoisomerase(위상 이 성 질 화 효소).

6 두 종류의 핵산 가수분해효소 반응

7 Nuclease(핵산 가수분해 효소) 핵산 분자를 자르거나 분해하는 효소.
DNA 가닥 내 phosphodiester(인산 이 에스테르) 결합을 절단. Exonuclease : 3’ → 5’, 5’ → 3’ Bal 31(Alteromomae espejiana):이중나선 DNA 말단을 절단함.

8 Exonuclease 의 상이한 반응

9 Nuclease(핵산 가수분해 효소) Endonuclease : DNA 가닥의 내부를 절단함.
• S1 Endonuclease : 이중가닥 DNA 내의 단일가닥 부위를 절단함(Aspergillus oryzae 에서 분리). • DNase Ⅰ: 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 내부를 절단함. 소의 십이지장에서 추출. • Restriction Endonuclease(제한효소). 이중가닥 DNA 내의 특정 인지 부위를 절단함.

10 다양한 핵산가수분해효소의 기능

11 DNA Modifying Enzyme(DNA 수식효소)
Alkaline Phosphatase. 대장균, 송아지의 장에서 추출. 5’-P 말단제거 5’-OH로 수식. Polynucleotide Kinase. T4 phage 에 감염된 대장균에서 추출. 5’-말단에 인산 기를 첨가. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase 송아지 흉부조직에서 추출 ’- 말단에 1~3개의 deoxynucleotide 첨가.

12 DNA 수식효소의 반응.

13 그 이외의 효소 Ligase(연결 효소). ds DNA 내의 틈(nick) 및 두 단편을 연결시킴.
Topoisomerase(위상 이 성 질 화 효소) Gyrase : Super coil form → CCC-form. Polymerase(중합효소): 상보가닥합성 DNA polymerase I : DNA 합성(교정 기능). Klenow fragment : 교정 기능 없는 중합효소. Reverse transcriptase(역 전사 효소) TMV에서 추출한 효소로 주형과 primer가 필요함.

14 DNA 연결효소의 기능

15 DNA 중합효소의 기능

16 역 전사 효소의 기능

17 Restriction Endonuclease(제한효소)
1950. Bacteriophage 에 면역력이 있는 세균에서 발견된 효소. 숙주세포의 제한작용(Host Controlled Restriction). 숙주세포가 파지 DNA 분해효소 분비. I, III type 효소 : 제한부위 이외의 부위절단 유전공학에서 지극히 한정된 역할. II type 효소 : 제한 부위 내 절단. 평평(평활) 말단 : Blunt end , Flush end. 점착성 말단 : Sticky end, Cohesive end.

18 제한효소의 종류 및 인식부위

19 제한효소와 인지서열

20 제한효소 처리 후 절단

21 DNA 분자 내 인식 염기서열의 빈도 Sau 3 A : GATC 4개의 염기서열 인식한다면, GGGG, GGGA, GGGT‥‥ 1/44 = 1/256. Bam H1: GGATCC 6개의 염기서열 인식한다면, GGGGGG, GGGGGA,‥‥ 1/46 = 1/4096. ⋋ DNA(49 kb)를 Sau3A로 처리한다면, 이론적으로 49000/256 = 191개의 절편 생성. ⋋ DNA(49 kb)를 Bam H1으로 처리 한다면, 이론적으로 49000/4096 =11.9 ≒12개의 절편 생성.

22 ⋋ DNA 의 제한효소 부위 (단편의 크기와 수)

23 ⋋ DNA의 제한효소 부위 (단편의 크기와 수)

24 DNA 분자 내 인식 염기서열의 빈도 실제로 제한효소 처리 시 Bam H1 = 5, Sau 3A = 10개의 절편 생성.
GC content 의 차이가 있으며, 제한효소 인식 부위가 골고루 존재하지 않기 때문임. 수학적으로 예상 가능하지만, 실험적 분석만이 정확한 절편의 수를 알 수 있음.

25 제한효소 처리(BglⅡ)

26 제한효소 buffer(10x) Ⅱ형 제한효소 : 활성을 갖기 위해 Mg+2 요구.
효소의 안정성과 불활성화를 막기 위하여 dithiothreitol을 첨가. 모든 제한효소에 알맞은 buffer 사용해야 함.

27 제한효소 buffer(10x)

28 제한효소(Bgl Ⅱ) 처리 E-tube에 DNA transfer(2 ㎍/16 ㎕). 총 반응 액 결정 : 20 ㎕.
제한효소 buffer add(10x →1x). 20 ㎕ × 1/10 = 2 ㎕. 제한효소 add : 2 ug이므로 2 unit add. Bgl Ⅱ: 4 unit/㎕ 이므로 0.5 ㎕ add. 총 반응 액 20 ㎕ 맞추기 위해 ddH2O 1.5 ㎕ add. 37℃에서 1hrs 이상 반응 : Full digetion. 제한효소 1unit 란? 한 시간에 DNA 1 ug을 절단시킬 수 있는 효소의 양.

29 제한효소(Bgl Ⅱ) 처리 37℃에서 30분 반응 : Patial digetion 대부분의 제한효소 37℃가 최적온도 이나, Taq1 효소는 65℃ 최적온도 임. 제한 효소 기능 억제(가열, EDTA, Phenol). Agarose Gel Electrophoresis(전기영동). 모양, 크기, 전하 량에 따라 절편이 분리됨. 5 – 60 kb : 0.3% slab gel 이용 보통 0.7% slab gel 이용 함. EtBr 염색(0.5 ㎍/㎖) : 분.

30 DNA 전기영동(Horizontal)

31 Agarose Gel Electrophoresis

32 DNA 전기영동(Vertical) 0.3 mm polyacrylamid gel: 1-300 bp 분리함.

33 EtBr 염색 후 UV에서 관찰

34 방사능으로 처리된 DNA 방사선 사진(Autoradio Graphy)

35 방사선 동위원소 부착 법

36 DNA Transfer

37 Southern Blotting

38 Agarosegel 내 DNA 단편 크기 측정

39 제한효소 지도 작성

40 DNA 분자 연결(Linker DNA)

41 DNA분자 연결(Adaptors)

42 DNA 분자 연결(Tailing method) Terminal deoxynucleotidyl transferase