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2 학습목표 1. 2가지 형태의 세균 DNA와 그들의 복제 과정 2. 돌연변이 정의와 원인, 돌연변이원의 역할
3. 수평적 유전자 전이를 통한 3가지 유형의 유전자 재조합 방법 4. 유전공학의 시작 재조명, 생명공학에서의 유전자 재조합의 역할

3 1968년 중앙아메이카의 과테말라에서 이질이 발생  사람의 장에 영향을 미쳐 강한 복부경련, 출혈 및 점질성 대변  수분의 양을 감소  shigellosis  그람음성 간균인 Shigella sp.  치료 : 탈수예방을 위한 소금 및 식염수를 섭취  항생제치료 : 테트라사이클린, 클로람페니콜, 설파닐아마이드, 스트렙토마이신  결과적으로 효과를 보이지 못하였다. 원인) 항생제내성이 원인 1990년대 집단으로 발생  황색포도상구균(S. aureus) Super Bacteria  Methicillin-resistance Staphylococcus aureus, MRSA  Vancomycin-resistance Enterococcus faecium, VRE  MRSA 종이 vancomycin에 대한 내성이 증가  VISA (Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus)

4 10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드 - 38억년간 존재하며, 유전적 변화의 결과
 유전적 변이와 환경적응  생명체의 탄생과 죽음  환경에 적응하지 못하는 생명체는 도태된다. - 이의 중심  유전자의 변이 (돌연변이) 세균의 염색체 염색체(chromosome)  유전정보의 대부분을 포함  DNA의 구성 (닫힌 고리모양의 이중나선구조)  진핵생물과 달리 지지체 역할을 하는 단백질이 결여 : 세포 내에 자유로이 존재, 세균 세포의 절반을 점유 : 1.5mm (세포크기의 1,000배, 2um) : 10,000개의 염기간격으로 고정된 점에 연결 (꽃 모양을 가짐)  유전자의 수 : 대장균 (4,300개), 바이러스(7개), 인간(19,000개)  반 보존적복제(semiconservative replication) : 증식시 1가닥이 새로 합성, 모 DNA의 한 가닥 만이 새로운 DNA로

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10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드 © 2013 published by World Science Co.

6 10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드  복제과정
: 복제 개시점(origin of replication)  V자 모양의 복제분기점을 형성  분기점의 한 쪽으로 복제 개시점에서 DNA가 연속적으로 합성  다른 한 쪽은 불연속적으로 합성  DNA 리가제 (DNA ligase)  단편을 연결하는 효소(Okazaki fraction)  1968년 레이지 오카자키 가설로 명명 - 원형세균 염색체복제는 복제개시점(oriC)이라 불리는 DNA 위의 특정한 지점에서 시작 - 개시 단백질들이 DNA위의 복제개시점 염기서열에 결합 - 복제에 필요한 다른 단백질등이 추가되어 복제복합체를 형성

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10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드 - 복제복합체는 세포막에 부착되고, DNA가 풀리고, 분리하고, 상보적 가닥을 합성에 필요한 다양한 단백질들로 구성 - 복제가 진행할 때 복제복합체는 복제포크에서 부모형 DNA(검정색)를 밀고 나가서 주형가닥에 대해 상보적인 가닥(주황색)을 합성, DNA고리를 형성 © 2013 published by World Science Co.

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10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드 그림 10.2 - 복제는 복제 복합체가 염색체 상에 있는 복제 개시점의 반대 위치에 도착하면 완성 - 종결지점에서 종결단백질이 결합하고 복제 복합체는 흩어진다. - 각각의 딸 염색체는 하나의 부모형 가닥(검정색)과 하나의 새로 합성된 가닥 (주황색)으로 구성 © 2013 published by World Science Co.

9 10.1 세균 DNA : 염색체와 플라스미드 플라스미드 - 많은 세균에서 발견 (진핵세포에서는 발견이 안됨)
- 전체 정보량의 2%, 복수로 존재, G-, - 세균의 필수적인 요소는 아니지만 선택성을 부여 예) R (Resistance) plasmid  항생제 내성을 부여하는 유전자를 보유 - 타 세균에게 전달이 가능 (약제내성 세균의 증가를 초래) - 독소 단백질을 생성할 수 있는 유전자를 가짐 (bacteriosin, Bacillus sp.)  타세균에 유독, 생존전략에서 이겨낼 수 있도록 독소단백질을 생산  경쟁우위

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11 10.2 유전자 돌연변이 : “알림 없는 변화” - 유전정보의 변화  돌연변이와 재조합
- 유전정보의 변화  돌연변이와 재조합 - 돌연변이(mutation)  생물의 DNA가 영구적으로 변화된 것  유전자의 염기서열 파괴, 결실 등  mRNA  단백질의 변화  단백질의 변화로 항생제 작용부위를 변화  내성유발 돌연변이의 원인 - 생물학적인 돌연변이  109~10 개체(10억번째)마다 1회 자연돌연변이 유발  항생제 작용으로 999,999,999균주는 사멸, 1균주는 생존(변이체) - 돌연변이원(mutagen) 유도 돌연변이 (induced M.) 1) 물리적인 변이  빛 (자외선)  DNA, T염기 두 개가 결합  유전자의 기능(단백질)의 변화 2) 화학적인 변이  아플라톡신, Benzoapyrene(특정염기의 삽입과 결실), 질산(그림 10-5)-DNA에 잘못된 염기 쌍을 만듬 sulfanilamide(엽산생성을 저해) 등 - 점돌연변이 (point M.) : 하나의 염기가 다른 염기로 대체되는 것을 말함  생산된 단백질의 구조나 기능에 영향이 없으면 중성돌연변이 또는 침묵돌연변이라 함 - 미스센스돌연변이 : 치환등으로 인해 기능이 떨어지거나 새로운 기능을 가진 단백질이 생산

12 10.2 유전자 돌연변이 : “알림 없는 변화” 자외선은 같은 DNA가닥 내에서 근접한 티민 분자들 사이에 비특이적인 염기쌍 형성을 유도

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10.2 유전자 돌연변이 : “알림 없는 변화” © 2013 published by World Science Co.

14 10.2 유전자 돌연변이 : “알림 없는 변화” 염기 하나가 다른 것으로 대체됨 THE FAT CAT ATE THE RAT
“Neutral” = 아직 정상적인 단백질을 생산함 “Missense” = 틀린 단백질 생산 “Nonsense” = 기능을 가진 단백질 생산 못 함 THE FAT CAT ATE THE RAT THE FAT CAT ATE THE RAT THE FAT CAR ATE THE RAT THE FAT CA

15 10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 + - 약제내성(E. coli) + 약제 민감(Shigella)  혼합배양
- 전이기전(유전자 재조합)  수평적 유전자 전이 (horizontal gene transfer; HGT) 1) 접합 2) 형질도입 3) 형질전환 - 유전자 재조합의 중요성  2000 논문에 의하면 인간의 보편적인 대장균 DNA중 약 20%(4,288 유전자중 755개)가 타 미생물로부터 획득  Thermotoga maritima 서로다른 세균과 고세균의 두 원핵세포 그룹에서 25%를 획득  뛰어난 유전자 교환 및 획득  항생제 저항의 문제를 야기 + E. Coli + Shigella - Shigella +

16 10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 수직적 유전자 전이: 이분법에 의한 딸세포
수평적 유전자 전이: 공여세포에서 수용체 세포로 DNA가 직접 세포 내부로 이동

17 10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 접합(conjugation) - 살아있는 두 세균의 작용
 - 살아있는 두 세균의 작용  - 공여하는 세포가 유전물질의 일부를 수용세포에게 전이하는 재조합과정  - 공여체 F+, 수용체 F-  - Lederberg & Tatum에 의해 제안    공여체의 plasmid → F factor (20여 개의 유전인자)     F pill를 통한 접합다리를 통하여 유전물질을 이송 (그림 10.7)    Shigella, E. coli, Salmonella 등

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 © 2013 published by World Science Co.

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합  - 약제저항성에 관련된 유전자의 전이에 중요한 역할  - F인자가 염색체와 접촉을 하여 DNA를 제공하는 세균 고빈도재조합 균주(high frequency recombination, HFR) - 그림 10.6      염색체 일부분이 이동 : DNA를 제공하는 균주 항생제 저항 유전자가 염색체내에 존재 : Hfr 균주는 수용세균으로 전이 : 전체 염색체가 아닌 일부 염색체가 이동하여 재조합됨 © 2013 published by World Science Co.

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 형질도입  - 유전자 전이가 세균성 바이러스(bacteriophage)의 도움으로 진행  - 용균과 용원과정은 형질도입과정을 초래  - 일반적인 형질도입과정 (그림 10.8)  복제과정 중 새로 형성된 파지의 일부분이 세균의 플라스미드나 DNA 유전자 단편을 포함  용원과정을 통하여 숙주세포의 유전자에 삽입이 되어 새로운 유전형질을 가짐  - 일반대장균  비병원성      형질도입과정을 통하여 독성을 띠는 병원성 유전자(베로톡신)가 도입ㆍ발현되어        병원성을 띠는 대장균이 발생      O157:H7  © 2013 published by World Science Co.

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 © 2013 published by World Science Co.

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 © 2013 published by World Science Co.

23 10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 형질전환 - 극히 제한된 비율로 주변환경으로부터 유전자를 획득
형질전환   - 극히 제한된 비율로 주변환경으로부터 유전자를 획득  - 세균의 DNA 단편이 수여세균의 competence factor를 통하여 유전인자를 획득    (수용능 인자: DNA 단편이 세균세포막을 통과하는 것을 도와주는 단백질 분자)  - 전환과정

24 10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 전이인자  도약유전자 (transposons)  매클린톡, 점핑 유전자를 발견, 1983년 노벨상수상 - 한 염색체내에서 다른 위치로… 한 염색체내에서 다른 염색체로 이동하는 유전자를 발견 - 다른 유전자의 중간에 끼어 유전자를 파괴하는 기능 - 옥수수에서 색소유전자를 파괴하여 점박이 옥수수알갱이를 형성 - 원핵생물, 진핵생물에 모두존재 - 돌연변이 발생원으로 작용  유전적 다양성의 원인, 진화의 중요한 인자 © 2013 published by World Science Co.

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10.3 유전자 재조합 : 유전자 혼합 오늘날의 세계  - 기회성 세균인 황색 포도상구균  - 피부, 입, 코에 정상적으로 서식  피부선이나 점질막으로 침투  질병을 유발(농증)      심한 경우 패혈증(혈액 감염), 간염(간장 감염), 엔도카르티티스 (심장변막 감염)        뇌막염(신경망의 감염)      다재내성 황색포도상구균(multidrug -resistant staphylococcus aureus, MRSA)         (다양한 항생제에 대한 저항능력을 소유)  1997년 벤코마이신 매개 황색포도상구균 내성 (Vencomycin intermediated – resistant staphylococcus aureus, VISA) - 결핵  2세기 동안 10억명을 사망, 세계 20억의 인구중 30%가 보균자  다재내성결핵(multidrug -resistant tuberculosis, MDR-TB)_치료환자의 20%  광범위 약제내성결핵(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB) © 2013 published by World Science Co.

27 10.4 유전공학 : 계획적인 형질전환 세균 DNA의 변환을 유도할 수 있는 생명공학기술의 도입 유전공학의 시작
 - 핵산내부 가수분해효소, 엔도뉴클레아제(endonuclease)  - 이 효소가 세균세포 내에서 파지 핵산을 파괴시켜  파지의 복제를 제한한다는 사실로부터      제한효소(restriction enzyme)라 불림  핵산의 뼈대인 당 인산결합을 절단  - 아르버 (Werner Arber) : 1960년 선택된 지점에서 파지 DNA를 절단하는 효소  - 스미스 (Hamiton Smith) : 그람음성 간균인 H. influenzae에서 제한효소 분리  - 네이선스 (Daniel Nathans) : 원숭이 바이러스인 SV40를 절단하는데 스미스의 세균 효소를 이용 - 위 세명의 과학자는 1978년 노벨상 수상 - 이후 수 백종의 다른 제한효소가 분리, 정제되어 그 특성이 규명  - 제한효소 x  동 · 식물 및 미생물의 DNA에서 정해진 X 지점의 유전자를 절단

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29 10.4 유전공학 : 계획적인 형질전환 최초 재조합 DNA분자
 - 버그(Paul Berg) : SV40의 DNA분자를 제한효소로 절단하여 세균염색체와 조합      최초의 재조합 DNA 분자를 제조  1980년 노벨상수상 (생어-길버트 등과 함께)  - 보이어 (Boyer)와 동료 : 접착말단(staggered end)을 가지도록 염색체로 절단하는 효소를 발견 (그림 10.11)      EcoRI (E. coli RY13 균주유래 첫 번째 효소라는 의미)    - 말단 사이에 정확한 연결을 위해 DNA ligase를 사용      인산그룹과 다른 쪽의 당 분자와의 화학적 결합 : "phosphodiester band"  

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31 10.4 유전공학 : 계획적인 형질전환 재조합 DNA 분자의 이용
 - 코언 (Stanley Cohen) : 플라스미드 유래 최초의 재조합 DNA분자  Plasmid(12~수천 유전자)  접합 (세포 밖에서 안쪽으로 쉽게 통과)  대장균 플라스미드  EcoRI 처리  특이 인식부위 절단      플라스미드  아프리카 두꺼비의 리소솜에 코드되어 있는 단백질 유전자를 삽입     새로운 세균에 키메라 플라스미드를 삽입 (차가운 Ca에 현탁. 빠르게 42℃로 가열 세균에 플라스미드 삽입)     세균으로부터 관련 효소의 발현산물을 확인

32 10.4 유전공학 : 계획적인 형질전환 미치는 영향 - 인간윤리위원회를 구성 _ 공공의 안전성을 확보
 - 생명공학의 새로운 분야 (그림 10.12, 13)  식량생산, 신의약품의 합성, 오염제거 및 인간의 관심분야를 해결      기름오염물질을 분해하는 효소, 질병에 대한 백신생산 등등 기대  - 문제점      대중을 대상으로 한 바이오 테러를 위한 생물무기의 제작과 사용        (천연두바이러스, 탄저병 등 )  - 유용성을 극대화 할 수 있는 노력과 산물       췌장세포에서가 아닌 세균에서 인슐린의 합성 (휴물린)      혈액응고 (혈우병 환자)      성장호르몬 (키작은 어린이)  인터페론 등 - 농업, 의학적진단, 범죄과학, 의약품연구 등에 놀랄만한 성과를 도출…..

33 10.12 새로운 의약품에 대한 FDA승인 (1985~2013)

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36 세균 염색체와 플라스미드가 어떤 기능을 가지며 어떻게 구성되어 있는가.
DNA 분자의 복제에 사용되는 과정들. 돌연변이는 무엇이며 그들은 어떻게 발생되는지? 유전자 재조합을 위한 3가지의 HGT. 유전공학 연구는 어떻게, 생명공학에서의 의미는?