오염지표 미생물 검사 강원도가축위생시험소.

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1 오염지표 미생물 검사 강원도가축위생시험소

2 목 차 가. 낙하세균 검사 나. 일반세균 검사 다. 대장균 검사 라. 대장균군 검사

3 -> 검출시 식품의 제조, 가공 또는 저장 중에
용어의 정의 낙하세균수 : 작업장 오염도 모니터링 일반세균수 : 식품중의 신선도 감별 대장균군 : 환경관리상의 위생척도 (자연계에 널리 분포) -> 검출시 비위생적인 처리를 의미 ◈ 대장균군이란 ? 장내에 서식하는 그램음성 간균.유당을 분해하여 산과 가스를 발생하 는 호기성·통성 혐기성균. 대 장 균 : 대장균군의 대표적인 세균. 분변오염의 지표 -> 검출시 식품의 제조, 가공 또는 저장 중에 직·간접적으로 분변에 오염된 것을 의미

4 권 장 기 준 낙하세균 1 1. 오염작업구역 : 낙하세균수(생균수) 100 개 이하
2. 준청결작업구역 : 낙하세균수(생균수) 50 개 이하 3. 청결작업구역 : 낙하세균수(생균수) 30 개 이하 낙하진균수(곰팡이·효모) 10 개 이하 ** 단, 측정은 작업중에 (법적인 규제사항은 아님)

5 낙하세균 검사 낙하세균 2 표준한천평판배지를 넣은 페트리접시 2~3개 사용
세균집락수를 count하고 그 평균치를 구한다. 37℃(±1.0 ℃)에서 48시간(± 3시간)동안 배양 작업중 바닥에서 cm 높이에 놓고 뚜껑을 열어 5분간 수평으로 방치한 후 뚜껑을 덮는다. 표준한천평판배지를 넣은 페트리접시 2~3개 사용

6 낙하진균 검사 낙하세균 3 포도당한천배지(SDA) 2~3개 사용 (클로람페니콜 또는 테트라싸이클린 50-100mg/L 첨가)
진균집락수를 count하고 그 평균치를 구한다 23℃(±2.0 ℃)에서 7일간 배양 바닥에서 cm 높이에 놓고 뚜껑을 열어 20분간 수평으로 방치한 후 뚜껑을 덮는다 포도당한천배지(SDA) 2~3개 사용 (클로람페니콜 또는 테트라싸이클린 mg/L 첨가)

7 일반세균 검사 (표준평판배양법, aerobic plate count)
일반세균 1 일반세균 검사 (표준평판배양법, aerobic plate count) 중 첩 : 집락의 확산을 억제하기 위하여 표준한천배지 3-5ml을 가한다. 배지 분주 : 배지(Standard plate count agar) 15ml을 분주 후 회전하여 시료와 배지를 잘 섞고 응고시킴 단계 희석 : 10진 희석법으로 희석, 각 단계 희석액(10-2, 10-3, 10-4) 1ml씩 멸균 페트리디쉬 (2매이상)에 무균적으로 취한다. 시료 제조 : 채취한 시료 10ml(g)과 희석액 90ml 을 혼합 배 양 : 거꾸로 하여 35 ± 1.0 ℃ 에서 약 48시간 배양

8 일반세균수 계산 일반세균 2 유효 평판 선택 : 평판당 25-250 (또는 30-300)개의 집락을 생성한 평판을 선택
기록 : 유효숫자 두자리까지 기록 계산 : 3번째 자리의 숫자가 6이상과 4이하인 경우 : 반올림 3번째 자리의 숫자가 5인 경우 : 둘째 자리수가 홀수일 때는 반올림, 짝수일 경우 버림 N = ∑ C / <(1 X n1) + (0.1 x n2)> X d ∑ C = 모든 평판에 계수된 집락수의 합 n1 = 첫번째 희석배수에서 계수된 평판배지수 n2 = 두번째 희석배수에서 계수된 평판배지수 d = 첫번째 희석배수에서 계수된 배지의 희석배수 구 분 희석배수 CFU/g(ml) 1 : 100 1 : 1,000 집락수 232 33 24,000 244 28 N = ( ) / < (1X2) + (0.1X0.2) > X 10-2 = 537 / = 24,409 = 24,000

9 일반세균 검사 (건조필름법) 일반세균 3 용 도 : 일반세균, 대장균 및 대장균군, 진균, 살모넬라균,
황색포도상구균, 등의 신속분석 원 리 : 얇은 필름에 영양소, 수용성 겔 및 균체 지시약들을 특수 코팅시켜 시료를 접종, 배양시키면 그 지시약에 의한 색깔 변화로 판정 특 징 - 정성 및 정량분석 기능 - 일정 배양시간이 필요하나 기존 평판배양법에 비해 신속 - 정확한 결과 판정이 어려울 경우도 있음

10 일반세균 4 종류 구조 종류 배양온도 (℃) 배양시간 (hr) 판 정 일반세균 32~36 24-48 붉은색 대장균군 24
붉은색, 기포 대장균 푸른색, 기포 속성 대장균군 6-20 노란색, 기포 장내세균 황색포도상구균 35(62) 24(1) 붉은색, 핑크색환 효모/곰팡이 21~25 72-120 효모 : 小,핑크~초록색 곰팡이: 大,불분명한외곽 살모넬라균 32-35 흑색

11 실험방법 일반세균 5 시료 준비 : 시험용액 제조 후 단계희석 (10배 희석)
집락수계수 : 필름 상 붉은 집락수 배 양 : 36℃ incubator에서 24-36시간 접 종 : 각 단계의 희석액을 1ml 씩 petrifilm에 떨어뜨린 후 필름을 덮어주고 누름판으로 눌러준다. 시료 준비 : 시험용액 제조 후 단계희석 (10배 희석) 세균수 산출 : 희석배수 X 집락수

12 사용방법 일반세균 6 상부필름을 걷어 올리고 하부필름의 중앙에 시료 1ml를 수직으로 접종한다. 대장균군과 대장균 배지는
중앙의 약간 윗부분에 접종한다. (접종과정에서 기포발생 방지) 상부필름을 부드럽게 위에서 아래로 덮는다. 이때 상부필름을 빨리 놓게 되면 기포가 생겨서 결과가 불명확해진다 균체수 = 16 배지내의 붉은색 염색지시약이 균체들을 염색. 균체의 크기에 관계없이 배지내에 염색된 모든 붉은색 균체들을 측정. 누름판을 필름상부에 올려놓고 살짝 눌러준다. (원이 형성되면 완료) 30초~60초 후에 겔화가 완료되면 배양기로 옮겨준다.

13 대장균·대장균군 검사 최확수법 (MPN, most probable number)
대장균수(E.coli ) & 대장균군수 1 대장균·대장균군 검사 최확수법 (MPN, most probable number) 1차판정 : 가스발생 시험관을 대장균군 양성으로 한다. 배 양 : 35±1℃에서 48±3시간 접 종 : 각 희석배수를 3개(또는 5개)의 BGLB (또는 LST배지) 발효관에 접종 희 석 : 시료액을 10진 희석하여 3단계이상 희석

14 2차판정 : 자외선 조사하에 푸른 형광이 관찰되는 시험관을
대장균수(E.coli ) & 대장균군수 2 균수산출 : 최확수표(부표 7 또는 부표 8)에 근거 2차판정 : 자외선 조사하에 푸른 형광이 관찰되는 시험관을 대장균 양성으로 판정 배 양 : 44.5℃에서 24시간 배양 2차접종 : EC-MUG배지(또는 BGLB-MUG, LST-MUG)에 접종 2 % B G L B m E C 발효관 MUG첨가 액체배지 MUG 첨가 평판배지

15 확인시험 대장균수(E.coli ) & 대장균군수 3 도 말 : 추정시험 양성 시험관을 EMB(MacConkey)배지에 도말
배 양 : 37℃, 24시간 배양 판 정 : 전형적인 집락 확인(금속성의 광택이 있는 집락) 확 인 : 그람염색(음성간균),  MUG 시험: 형광관찰·가스산생, IMViC:

16 Eosin Methyl Blue(EMB)Agar
MacConkey agar Eosin Methyl Blue(EMB)Agar E.coli 생화학적 시험결과 Gram염색소견

17 대장균·대장균군 검사 건조필름법 대장균수(E.coli ) & 대장균군수 4 대장균군 대 장 균
- 배지 : 대장균군용 건조필름배지 (coliform) - 양성집락 : 기포가 동반되고 붉은색을 띄는 집락 대 장 균 - 배지 : 대장균용 건조필름배지 (E. coli) - 양성집락 : 기포가 동반되고 푸른색을 띄는 집락 실험방법 : 일반세균 건조필름법과 동일

18 대장균수(E.coli) & 대장균군수 5 실험결과 (예:대장균필름) 대장균수 = 3 대장균수 = 50
대장균의 대사산물인 Glucoronidase가 배지내의 염색지시약과 반응하여 균체를 푸른색으로 발색. 대사과정에서 CO₂가스를 발생시켜 균체가장자리에 가스방울 동반. 총대장균군의 측정은 가스방울이 붙어 있는 붉은색 균체와 푸른색 균체를 모두 측정.

19 대장균수(E.coli) & 대장균군수 6 실험결과 (예:대장균군필름) 대장균군수 = 8 대장균군수 = 5
부적절한 균접종방법으로 인하여 인공 가스방울이 발생될 수 있으며 이들은 형태가 불규칙.