Site directed mutagenesis를 이용한 유전자의 기능 분석

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1 Site directed mutagenesis를 이용한 유전자의 기능 분석
분자유전학 연구실

2 실험목적 정의: DNA 염기서열에 특이적이고 의도적인 변화를 일으킬 수 있는 분자생물학적 기술
Site directed mutagenesis를 이용하여 template DNA를 mutation시킴으로써 유전자의 기능 분석에 이용할 수 있다.

3 예비보고서 Ex) Site directed mutagenesis를 이용한 예 1. 단백질기능 연구
- 아미노산 sequence를 변화시킴으로써 이와 연관성을 가지는 단백질에 의해 어떠한 변화가 일어나는지 알 수 있다

4 예비보고서 Site directed mutagenesis를 이용한 예 2. 효소의 기능 향상
Ex) Subtilin (non-specific protease), originally obtained from B. subtilis - 비특이적인 단백질 분해효소 - 섬유세제, 식기세제 성분 - a.a. 222 (Met)은 detergent에 의해 methionine sulfoxide로 산화되어 활성을 잃음  alanine 또는 다른 a.a.으로 교체하여 활성 유지 Subtilin 구조

5 Site directed mutagenesis를 이용한 예 3. MicroRNA: target mRNA 상호작용 분석
miRNA - 특정 mRNA와 결합할 수 있는 상보적인 염기를 가지는 20~25개의 짧은 Nucleotide로 구성된 RNA이다. - mRNA와 결합하여 번역을 억제 하거나 target을 분해함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 3’ UTR - mRNA sequence 중 3’ 말단에 존재하는 번역 할 수 없는 지역.

6 예비보고서 Site directed mutagenesis의 원리
- Sequence가 알려진 template DNA를 mutation시킨다. - Primer의 일정부분의 염기를 template DNA 상보적이지 않게 제작함으로써 우리가 원하고자 하는 염기서열에 변화가 생긴 DNA를 얻을 수 있다. - Mutation 시킨 Template DNA를 vector에 삽입하여 mutation된 DNA를 얻을 수 있다.

7 실험 개요 - microRNA에 의해 직접 binding되는 DNA의 3’UTR자리를 mutation 시킴으로서 miRNA 가 이 위치에 binding하는지 확인 할 수 있는 실험. Ex) GENE A 3’UTR ' ... CUGCCAACCUGUGUGCCUUU...                        | | | | | | | hsa-miR '   CCGUAAGUGGCGCACGGAAU GENE A-mut 3UTR 5' ... CUGCCAACCUGUCUCCGUAU... GENE A GENE A mut 3’UTR miR-3656 상보적으로 결합한다 결합하지 못한다

8 실험개요

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11 실험방법 - Primer 제작 KDM-miR3656_3’UTR_Mut_F
5’ - GCA AAT TAC GCA ATT CTC AAG CCT CTT CTG -3’ Template DNA sequence 5’- GAT GTA GCA AAT TAC GCA AAT GTG AAG CCT CTT CTG ATA ACA - 3’ 3’- CGT TTA ATG CFT TAA GAG TTC GGA GAA GAC -5’ KDM-miR3656_3’UTR_Mut_R

12 실험방법 PCR Segment Cycles Temperature Time 1 95 30 seconds 2 12-18 56
1 minute 68 7 minute PCR product Primer dimer

13 실험방법 Dpn I digestion of the amplification products - Template DNA
 E.coli가 가지는 Dam methylase효소에 의해 새롭게 합성되는 DNA에서 sequence 5’-GATC-3’의 adenine 위치에 methyl group을 붙인다 - 새롭게 합성된 amplification product  E.coli가 스스로 합성해서 생성되는 DNA가 아니기 때문에 methylation되지 못한 상태

14 실험방법 따라서 methylation된 상태인 template DNA만이 Dpn I에 의해 digestion된다 .

15 실험방법 Transformation - mutation일어난 DNA를 얻기 위한 과정
- Dpn I 처리한 10ul PCR product 사용하여 실험

16 실험방법 Inoculation mini prep
- Transformation을 통해 생성된 colony 이용하여 inoculation과정 실시  한 종류의 plasmid DNA 선택하여 액체 LB에 키우는 과정 mini prep - plasmid DNA 분리

17 오늘의 실험 계획 PCR: point-mutation 된 primer를 이용하여 insert가 삽입된 vector를 증폭시킨다. DpnI 처리: genomic DNA 를 제거하기 위해 PCR sample에 Dpn1을 처리한다. DNA gel electrophoresis(전기영동): Dpn1 처리한 PCR sample에서 genomic DNA 가 제거 되었는지 확인한다. Transformation: Dpn1이 처리된 PCR product를(mutation된 DNA sample) competent cell에 주입하여 고체배지에 도말 한다. Mini-prep: 액체배지에서 증식 된 competent cell(mutant vector가 포함되어있는 cell)에서 DNA를 얻어낸다.

18 실험방법 PCR 과정 및 Dpn1 처리 준비된 PCR premix tube에 primer 와 DNA를 넣어준다.
PCR machine을 이용하여 DNA를 증폭시킨다. 완성된 PCR sample을 이용하여 Dpn1 을 처리해준다.

19 실험 방법 DNA gel electrophoresis(전기영동) - Add 3ul of loading dye (LD)
- load 10ul in the gel

20 실험 방법 Transformation Dpn1을 처리한 PCR product를 준비된 competent cell에 10ul 를 넣어준다. 2. 얼음에 5분 박아둔다. 3. Heat block 에 45초간 heat shock을 해준다. 4. 얼음에 2분간 박아둔다. 5. 액체배지 30 ul 를 넣어준다. 6. Plate에 도말한다.

21 실험방법 Mini-prep 상층액은 버리고 Buffer①(A1) 150ul를 이용해 pellet을 풀어준다
Buffer②(A2)를 250ul 넣어준 뒤 3-4회 inverting하여 섞어준다 Buffer③(A3)을 350ul 넣어준 뒤 3-4회 inverting한 후 10분간 centrifugation 상층액 만 DNA binding filter column으로 옮겨준다 1분간 centrifugation 후 통과된 액체 버려준다 450ul washing buffer(AQ) 넣어준다 한번 더 1분간 centrifugation을 통해 dry과정 거친다 50ul elution buffer(AE) 넣어준 후 1분간 기다린다 1분간 centrifugation을 통해 plasmid DNA 얻을 수 있다

22 예비보고서(생화학 연구실) 효소의 단위 효소 반응 속도론(Enzyme Kinetics)
Michaelis-Menten Equation Lineweaver –Burk Equation