Chapter 6. Recovery and Purification of Products

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1 Chapter 6. Recovery and Purification of Products

2 생성물의 회수와 정제 방안 회수와 정제 공정의 난점은 생성물의 성질에 크게 좌우되낟. 생성물은 세포 자체, 세포외 성분, 또는 세포내 성분이다. 발효액의 화학적 성질이 아주 복잡하고 어떤 생성물들은 아주 높은 순도를 요구하기 때문에 회수와 정제는 종종 많은 공정단계를 필요로 하고, 많은 경우에 제조비용에 있어서 생성물 생산보다 더 많은 비용이 든다. 관련되는 화합물들이 불안정하고 묽은 수용액으로 존재하기 때문에, 분리기술은 좀 더 전문적인 기술을 포함시켜 향상되어야 한다.

3 생성물의 회수와 정제에 사용되는 주요 단위조작과 분리의 주요원리

4 발효액으로부터 효소를 분리하고 정제하는데 수반되는 주요단계
4개의 기본적인 기능으로 일반화 - 불용성 생성물과 다른 고체의 분리 - 생성물의 1차 분리 또는 농축과 대부분의 수분 제거 - 오염 화학물질의 정제 또는 제거 - 건조와 같은 생성물의 제조 공정상 수분을 공정과정 중초기에 제거하여 후속과정에서의 시설 규모를 최소화 하는 것이 경제적이다. 기본적으로 생성물을 농축하기 위해 설계된 단계와 오염 화학물질을 제거하기 위한 단계는 흔히 용매를 제거하기 때문에 단계 2와 3사이에는 뚜렷한 경계가 없다.

5 생성물의 회수와 정제 방안 – 불융성 생성물의 분리
발효액으로부터 세포, 불용성 입자, 그리고 거대분자와 같은 고체의 분리는 보통 생성물 회수의 첫 번째 단계이다. 몇몇 경우에 있어서, 고체 분리를 촉진하기 위해 발효액을 전 처리할 필요가 있다. - 전처리의 예로는 열처리, pH 와 이온세기 조절, 그리고 응고제와 응집제의 첨가가 있다. 세포내 생성물의 회수에서는 세포를 파괴할 필요가 있고 다른 세포생성물을 원하는 생성물로부터 제거할 필요가 있다. 세포물질 (세포)의 분리에 사용되는 주요 방법 : 여과 (회전식 진공여과와 미세 – 또는 한외여과) 원심분리 응고와 응집

6 생성물의 회수와 정제 방안 – 여과 연속 회전식 진공 여과기 모식도

7 생성물의 회수와 정제 방안 – 원심분리 원심분리는 원심력에 의해 액체로부터 100에서 0.1µm 사이의 크기를 갖는 입자를 분리하는데 사용됨.

8 생성물의 회수와 정제 방안 – 응고와 응집 응고 (coagulation)와 응집 (flocculation)은 보통 원심분리, 중력침강, 또는 여과 이전에 이들 분리공정의 성능을 개선하기 위해 세포덩어리를 형성하는 데 이용됨. 응고는 보통 간단한 전해질인 응고제를 사용하여 분산된 콜로이드로부터 작은 덩어리를 형성하는 것임. 응집은 보통 다전해질 또는 CaCl2 같은 염을 응집제로 사용하여 이러한 작은 덩어리를 보다 큰 침강될 수 있는 입자로 집적 (agglomeration)하는 것임.

9 생성물의 회수와 정제 방안 – 세포의 파쇄 세포를 액상의 발효액으로부터 분리한 후 만약 원하는 생성물이 세포 내에 있다면, 세포내 생성물을 방출시키기 위해 세포를 분쇄할 필요가 있다. 분쇄방법은 세포 형태와 세포내 생성물의 성질에 따라 달라진다. 세포 파쇄의 주요 방법은 기계적인 방법과 비기계적인 방법으로 나뉨.

10 생성물의 회수와 정제 방안 – 세포의 파쇄 기계적인 방법

11 생성물의 회수와 정제 방안 – 세포의 파쇄 비기계적인 방법
삼투 충격 (osmotic shock)과 얼음결정을 이용한 파쇄가 흔히 사용됨. - cell paste를 천천히 얼린 다음 다시 녹이면 세포벽과 세포막이 깨져서 배지로 효소가 방출될 수 있음. 배지의 삼투압을 변화시키면 어떤 효소, 특히 그람음성균의 주변세포질 단백질이 방출됨. 어떤 미생물의 세포벽은 열 충격에 의해 파쇄 되기도 함. 아세톤, 부탄올, 그리고 완충용액으로 처리한 후 동결건조하면 세포벽이 파쇄됨. 라이소자임 (탄화수소분해효소) 같은 효소는 박테리아의 세포벽을 용해 (lysis)하는데 사용할 수 있음. 세포는 라이소자임으로 처리하기 전에 EDTA로 처리하거나 동결 용해시킨다.

12 생성물의 회수와 정제 방안 – 세포의 파쇄 비기계적인 방법
세포 가 용해되고 생성물이 배지로 방출된 후에 세포잔해는 초원심분리 (ultracentrifugation) 또는 한외여과를 사용하여 분리할 수 있다.

13 가용성 생성물의 분리 항생제, 유기산, 용매, 아미노산, 그리고 세포외 효소와 같은 대부분의 미생물에 의한 생성물은 가용성이고 세포외에 존재함. 가용성 생성물을 회수하기 위한 방법으로는 추출, 흡착, 한외여과, 그리고 크로마토그래피가 있음.

14 가용성 생성물의 분리 – 액체-액체 추출 액체 추출 (Liquid Extraction)에서 이상적인 액체 추출제는 독성이 없고, 선택성이 있고, 비싸지 않고, 발효액과 섞이지 않아야 하며, 생성물에 대한 높은 분배계수를 가져야 함. 분배계수: 어느 성분의 한 상에서 다른 상으로의 추출은 두 상에서의 용해도 차이에 근거함. 한 성분이 서로 섞이지 않는 두 액체 사이에 분배될 때, 두 상에서 농도비를 분배계수라고 함. YL 과 XH는 각각 가벼운 상과 무거운 상에서의 용질의 농도임. 대부분의 경우, 가벼운 상은 유기용매가 되고 무거운 상은 수용성 발효액이 됨.

15 가용성 생성물의 분리 – 액체-액체 추출 대부분의 항생제는 아밀아세테이트(amyl acetate) 또는 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate)와 같은 용매를 사용하여 발효액으로부터 추출함. 항생제 추출에는 보통 연속식 Podbielniak 원심추출분리를 사용함.

16 가용성 생성물의 분리 – 액체-액체 추출 페니실린은 낮은 pH (pH = 2~3)에서 유기 상에 더 잘 녹고, 높은 pH (pH = 8~9)에서는 수상에 더 잘 녹는다. 그러므로 페니실린은 생성물의 순도를 높이기 위하여 pH를 바꿔가면서 유기상과 수상 사이에서 여러 번 추출과정을 거친다. 발효액으로부터 회수되는 생성물 중에는 약산 또는 약염기가 있음. 이온화되지 않은 화합물은 유기상에 녹으므로, 추출되는 화합물이 중성이고 유기용매에 잘 녹는 pH를 선택함. 그러므로 약염기는 높은 pH에서, 약산은 낮은 pH에서 중성형태로 추출함.

17 가용성 생성물의 분리 – 액체-액체 추출 발효액이 둘 이상의 성분을 포함하면, 용매의 선택도 (selectivity)(ß)는 중요한 매개변수가 됨. 선택계수 (ßij)는 분리의 용이도는 ßij 값에 따른다. ßij 값이 높아질수록 j 로부터 i의 분리가 더 쉬워짐. 종종, ßij 값은 pH에 따라 많이 변하고 분리는 더 쉬워진다.

18 가용성 생성물의 분리 – 수성 이성분계 추출 수성 이성분계 추출은 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG)과 덱스트란 (Dextran)과 같이 서로 섞이지 않는 고분자를 포함하는 두 상 사이에서 효소와 같은 가용성 단백질의 추출을 위하여 적극적으로 개발되고 있는 방법임. PEG 와 Dextran 을 포함하는 상은 75% 이상이 물이고 서로 섞이지 않는다. 이러한 목적으로 사용되는 전형적인 수상으로는 PEG-물/Dextran-물과 PEG-물/K 인산염-물 이 있다. PEG/Dextran 과 PEG/K 인산염은 잘 섞이지 않는다. 분배계수 (Kp)는 지수함수 형태로 가용성 단백질의 분자량에 따라 다르다. Kp = expAM/T

19 가용성 생성물의 분리 – 수성 이성분계 추출 많은 효소에 있어서 두 상 (CPEG – CDEX) 사이의 분배계수 (KP)는 1과 3.7 사이이므로 다단으로는 분리가 잘 안 됨. 분배계수는 두 상 중 하나에 이온교환수지 또는 (NH4)2SO4 와 KH2PO4 같은 염을 첨가하여 개선할 수 있음. KH2PO4 농도가 0.1에서 0.3M로 증가됨에 따라 KP 값은 10배 이상의 증가를 보임. PEG-염계에서는 염석 (salting-out)으로 인하여 경계면에서 단백질이 침전될 수 있음.

20 가용성 생성물의 분리 – 수성 이성분계 추출 추출공정 후 두 상은 원심분리 또는 경사분리 (decantation)를 사용하여 분리하고 PEG는 한외여과로 회수함. 아래 그림은 PEG 회수를 포함하는 이성분계 분배 방법을 사용한 효소 분리 장치의 블록선도 (block diagram)임. 이 분리방법은 빠르고, 적절한 온도, 압력, pH 조건에서 운전될 수 있음.

21 가용성 생성물의 분리 – 침전 세포파괴 후 세포내 생성물을 정제하는 첫 번째 단계는 보통 단백질의 침전 (precipitation)임. 세포용해 전후의 발효액에 들어 있는 단백질은 염을 사용하는 침전에 의해 다른 성분으로부터 분리됨. 염의 예로는 스트렙토마이신 황산염과 황산암모늄이 있음. 단백질 침전에 사용되는 두 가지 주요방법. - 높은 이온세기에서 (NH4)2SO4 같은 무기염의 첨가에 의한 염석. - 낮은 온도 (T < -5oC)에서 유기용매 첨가에 의한 용해도 감소.

22 생성물의 회수와 정제 방안 – 흡착 액체 배지로부터 고체위로 용질을 흡착 (adsorption) 시키는 방법은 발효액으로부터 가용성물질을 분리하는데 흔히 사용됨. 물리적인 흡착에서는 반 데르 발스 힘 같은 약한 힘이 우세하나, 이온교환흡착에서는 강한 이온결합을 사용함. 용질은 액상에서 고체상으로 전달되어 회분운전에서 일정한 시간 후에 평형에 도달함.

23 생성물의 회수와 정제 방안 – 흡착 폐수처리에 가장 널리 사용되는 흡착제는 활성탄으로서, 단위 무게 당 큰 내부표면적을 갖고 있기 때문임. 이온교환수지와 고분자흡착제는 단백질 분리 또는 작은 유기물질에 사용됨. 예, 카르복실산 양이온교환수지는 스트렙토마이신을 회수하는데 사용됨. 흡착용량은 흡착제, 흡착되는 물질, 물리화학적인 조건, 그리고 흡착제와 흡착되는 물질의 표면특성에 따라 달라짐. 보통, 흡착에 대한 정확한 기작은 잘 밝혀져 있지 않고 평형 값도 실험적으로 정해져야 함.

24 생성물의 회수와 정제 방안 – 흡착 여러 형태의 고체와 액체의 접촉 장치가 용질의 흡착을 위해 개발 되어 왔음. – 충전층, 이동층, 유동층, 또는 교반용기 접촉장치 충전층과 이동층 접촉 장치는 반응기의 단위부피 당 흡착면적이 다른 것에 비해 가장 크기 때문에 가장 널리 사용됨.

25 생성물의 회수와 정제 방안 – 투석 (dialysis)
투석은 용액으로부터 유기산 (100<분자량<500)과 무기이온 (10<분자량<100) 같은 저분자량의 용질제거에 사용되는 막분리 조작임. 투석막의 분획분자량 (MW cutoff)이 매우 작기 때문에 저분자량의 용질이 고농도에서 저 농도 영역으로 이동함. 평형에서, 막의 양면의 확산성분의 화학포덴셜 (chemical potential)은 같음.

26 생성물의 회수와 정제 방안 – 역삼투 발효액에 삼투는 두 상이 선택적인 막으로 나뉘어져 있을 때 물 분자의 고농도영역으로부터 저농도 영역으로의 (다시 말해서, 순수한 물로부터 염을 포함한 수용액으로) 이동을 의미함. 역삼투 (Reverse Osmosis) (RO)에서는 염을 포함하는 상에 압력이 가해짐. 이 압력은 저농도 영역으로부터 고농도 영역으로 물(용매)분자를 이동시켜 막의 한 면에 용질(염)분자를 농축시킴.

27 생성물의 회수와 정제 방안 – 한외여과 (ultrafiltration)
한외여과막은 비등방성구조 (anisotropic structure) 때문에 대부분의 미세다공 여과기와 다름. 비등방성막에서는 작은 구멍이 있는 얇은 표피가 두껍고 다공성이 높은 구조의 상부에 형성됨. 얇은 층은 선택성을 제공하는 반면에 더 뚜꺼운 층은 기계적인 지지를 제공함. 미세다공 여과기 (microporous filter)는 열린, 굽은 경로의 구조를 가져 여과기 내에 입자의 포획을 일으키는 반면에, 일정한 크기의 확실한 구조의 구멍을 갖는 것들도 있음. UF 막은 백신, 발효생성물, 효소 그리고 다른 단백질을 분리하기 위해 제약, 화학 그리고 식품산업에 널리 사용됨. 한외여과는 화학물질과 생성물질을 고순도로 농축하는 데 사용되는 에너지 효율적이고 경제 분리적인 분리 방법임.

28 생성물의 회수와 정제 방안 – 한외여과 (ultrafiltration)
RO는 고압이 필요하고 용매제거에 기초를 두고 있기 때문에 생물분리에서는 그 응용이 제한됨. RO 막은 보통 수분제거와 농축의 목적으로 사용하지만 단백질분리에는 보통 사용하지 않음. RO 막의 또 다른 문제는 막표면 위에 용질분자가 침전 (deposition)되어 용매 흐름에 큰 저항을 주는 것임. 이 현상은 농도 분극 (concentration polarization)으로 알려져 있고 막 표면위의 난류정도를 증가시킴으로써 극복될 수 있음.

29 생성물의 회수와 정제 방안 – 한외여과 (ultrafiltration)
교차흐름 한외여과 - 젤 형성은 압력이 막에 직접 수직으로 걸리지 않고 막 표면에 수평으로 걸리는 교차흐름 여과기 (cross-flow filtration)에 의해 부분적으로 제거됨. 즉, 유체는 막표면에 수평으로 흐르면서 막을 통과하여, 막 위의 액상에 용질을 남김. - 기계적인 교반 또는 막표면의 진동 또한 젤 형성을 경감하는 데 사용됨. 교차흐름 여과기의 모식도

30 생성물의 회수와 정제 방안 – 한외여과 (ultrafiltration)
실관형 (hollow fibers), 평판형 (flat sheets), 그리고 나선감김형 (spiral-wound) 카트리지의 구조.

31 생성물의 회수와 정제 방안 –크로마토그래피 크로마토그래피는 다공성, 고체, 흡착매체에서 유체흐름에 의해 여러 화합물을 분리하는 것임. 입자상 물질인 흡착매체에서 용질의 서로 다른 이동특성 때문에 성분들은 다른 band를 형성하며 분리됨.

32 생성물의 회수와 정제 방안 –크로마토그래피 흡착 크로마토 그래피 (Adsorption Chromatography)
- 약한 반데르발스 힘과 입체적인 상호작용에 의해 알루미나와 실리카젤 같은 고체입장 위에 용질분자가 흡착되는 것에 기초함. 액체-액체 분배 크로마토그래피 (Liquid-Liquid partition chromatography) - 흡착된 액상과 통과하는 용액사이에서 용질입자의 분배계수 (용해도) 차이에 기초함. 이온 크로마토그래피 (ion-exchange chromatography) - 정전기적인 힘에 의해 이온교환수지입자에 이온 (또는 전기적으로 전하를 띄는 화합물)이 흡착되는 것에 기초함. 젤 여과 크로마토그래피 (gel filtration (molecular seiving) chromatography) - 용질분자의 크기와 모양에 따라서 충전입자의 작은 구멍으로 용질분자가 침투하는 것에 기초함.

33 생성물의 회수와 정제 방안 –크로마토그래피 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)
- 용질분자와 지지입자위에 결합되어 있는 리간드 (지지입자에 공유적으로 연결되어 있는 기능성 분자) 사이의 특이한 화학적 상호작용에 기초함. 소수성 크로마토그래피 (hydrophobic chromatography) - 용질분자 (예, 단백질)와 지지입자 위의 작용기 (예, 알킬잔기) 사이의 소수성 상호 작용에 기초함. 고압액체크로마토그래피 (high-pressure chromatography) - 크로마토그래피의 일반적인 원리에 기초하는데, 충전관에 가해지는 높은 액체압력만 다름. - 고압의 액체 (높은 액체유속)와 조밀한 관 충전으로 인하여 HPLC는 용질분자에 대한 빠르고 높은 분리능을 줌.

34 생성물의 회수와 정제 방안 - 전기영동

35 정제의 마무리 단계 - 결정화 발효생성물 정제의 주요 마무리 단계로 결정화와 건조가 있음. 결정화
- 보통 결정화는 항생제같이 고도로 정제된 생성물의 생산에 있어서 마지막 단계임. - 결정화는 열에 민감한 물질의 열 변성을 최소로 하는 저온에서 운전됨. - 운전은 고농도에서 이루어지므로 단위비용은 낮고 분리인자는 높음. - 보통 어느 특정한 계에 대한 상선도 (phase diagram)와 적절한 반응속도론이 없기 때문에 최적 결정화 조건의 결정은 실험에 의해 경험적으로 이루어짐.

36 정제의 마무리 단계 - 건조 건조 - 정제된 젖은 생성물 (결정 또는 용해된 물질)로부터 용매를 제거하는 것은 보통 건조에 의해 이루어짐. 건조조건을 선택할 때에는 생성물의 물리적 특성, 열 민감성, 원하는 최종 수분함량을 고려하여야 함. - 건조에 영향을 주는 매개변수는 고체-액체계의 물리적 특성, 용질의 고유특성, 건조 환경 조건, 그리고 열전달 매개변수의 네 부분으로 분류될 수 있음. 진공판 건조기 - 한 용기 내의 가열된 선반들로 구성되며 보통 제약생성물에 사용된다. 이것은 작은 회분식으로 고가물질을 얻는 데 있어서 생성물 손실과 열손실을 최소화하는 좋은 방법임.

37 정제의 마무리 단계 - 건조 동결 건조 (freeze drying (lyophilization))
- 얼어 있는 용액으로부터 승화(고체얼음으로부터 증기로)에 의해 수분을 제거하는 방법임. - 건조시키기 전에 진공용기의 안이나 밖에서 냉동시킬 수 있다. 이 방법은 항생제, 효소액과 박테리아 현탁액에 사용됨. 회전통 건조기 (rotary-drum drier) - 결정용액에 좋지 않음. - 증기 가열된 회전통 표면위에 있는 얇은 용액 막으로의 열전도에 의해 수분이 제거됨. - 건조된 생성물은 배출지점에서 통으로부터 칼로 긁어모아짐.

38 정제의 마무리 단계 - 건조 분무 건조기 (spray dryer) - 생성물용액이 분사구를 통해 가열된 용기로 분무됨.
- 용기 내의 뜨거운 기체는 액체의 증발에 필요한 열을 제공함. - 건조된 입자는 사이클론을 사용하여 뜨거운 기체로부터 분리됨. - 분무건조기는 가격이 비싸지만 열에 민감한 물질에 선호되는 방법임.

39 Thank You